Onderzoeksmethoden in de histologie omvatten de bereiding van histologische preparaten en het onderzoek daarvan met behulp van licht- of elektronenmicroscopen. Histologische preparaten zijn uitstrijkjes, afdrukken van organen, filmpreparaten, dunne secties van stukjes orgel, gekleurd met een of andere kleurstof (native - ongekleurde secties worden ook onderzocht), op een glasplaatje geplaatst, in balsem ingesloten en bedekt met een dunne hoes glas.

Voor de vervaardiging van histologisch exemplaar Nadat het materiaal is ingenomen, is het noodzakelijk om het in een of ander fixeermiddel te fixeren (formaline, alcohol en voor elektronenmicroscopie - in glutaaraldehyde en osmiumtetroxide). Dit wordt gedaan om autolyseprocessen te voorkomen en de orgaanstructuur dicht bij intravitaal te behouden. Dit wordt gevolgd door de fasen van het dehydrateren van een orgaanstuk in alcoholen met toenemende concentraties en in xyleen om het weefsel te verdichten, wat nodig is voor het maken van dunne coupes. Om een ​​orgelstuk nog meer dichtheid en homogeniteit te geven en een hoogwaardige snijkwaliteit te garanderen, wordt het in een organisch medium gegoten - paraffine, celloïdine (voor lichtmicroscopie) en organische harsen (Epon, Araldite, Durcupan) - voor elektronenmicroscopisch onderzoek.

Er zijn ook fysieke methoden voor het bevestigen van materiaal, waarvan de meest voorkomende het snel invriezen van een stuk van een orgaan is met behulp van vloeibare stikstof en andere middelen. Om bevroren materiaal te snijden, worden speciale apparaten gebruikt: cryostaten of invriesmicrotomen.

Dikte van secties bedoeld voor licht microscopie, mag niet groter zijn dan 4-5 micron, voor elektronisch - 50-60 nm (dergelijke ultradunne secties worden gemaakt op een speciaal ultratoomapparaat, met behulp van glas- of diamantmessen en een automatische snijmodus).

Na ontvangst van de secties ze worden op glasplaatjes geplaatst, gevolgd door de stappen van het bevrijden van de secties van het montagemedium (voor lichtmicroscopie) en het kleuren om de secties contrast te geven. Van de histologische kleurstoffen is de meest gebruikte combinatie hematoxyline, dat de kern markeert (zure moleculen), en eosine, dat selectief eiwitmoleculen kleurt (cytoplasmatische kleurstof).

Nadat het kleuren is voltooid, secties ingesloten in conserveermiddelen (Canadees, cederbalsem) en bedekt met een dekglaasje.

De belangrijkste methode van histologisch onderzoek cellen, weefsels en organen is lichtmicroscopie. Een lichtmicroscoop gebruikt zichtbaar licht om een ​​object te verlichten. Moderne lichtmicroscopen maken het mogelijk een resolutie te verkrijgen in de orde van 0,2 micron (de resolutie van een microscoop is de kleinste afstand waarop twee aangrenzende punten als afzonderlijk zichtbaar zijn). Soorten lichtmicroscopie - fasecontrast, interferentie, polarisatie, donkerveld, enz.

Fasecontrastmicroscopie- een methode om cellen te bestuderen in een lichtmicroscoop uitgerust met een fasecontrastapparaat. Door de faseverschuiving van lichtgolven in een microscoop van dit ontwerp neemt het contrast van de structuren van het te bestuderen object toe, waardoor het mogelijk wordt levende cellen te bestuderen.

Interferentiemicroscopie. In een interferentiemicroscoop worden lichtstralen die op een object vallen in tweeën gesplitst: de ene straal gaat door het object, de andere passeert. Wanneer de bundels vervolgens herenigd worden, verschijnt er een interferentiebeeld van het object. Door de faseverschuiving van de ene straal ten opzichte van de andere kan men de concentraties van verschillende stoffen in het te bestuderen object beoordelen.

Polarisatiemicroscopie. Bij dit soort microscopen wordt de lichtbundel gesplitst in twee in onderling loodrechte vlakken gepolariseerde bundels. Terwijl ze door weefselstructuren gaan met een strikte moleculaire oriëntatie, blijven de stralen achter op elkaar vanwege hun ongelijke breking. De resulterende faseverschuiving is een indicator voor dubbele breking van cellulaire structuren (myofibrillen werden bijvoorbeeld op deze manier bestudeerd).

2. Objecten van histologisch onderzoek

3. Bereiding van histologische preparaten

4. Onderzoeksmethoden

5. Historische stadia in de ontwikkeling van de histologie

1. Histologie de wetenschap van de microscopische en submicroscopische structuur, ontwikkeling en vitale activiteit van weefsels van dierlijke organismen. Dientengevolge bestudeert histologie een van de organisatieniveaus van levend weefsel. Er wordt onderscheid gemaakt tussen: hiërarchische niveaus organisatie van levende materie:

mobiel;

stof;

structurele en functionele eenheden van organen;

orgaanniveau;

systeemniveau;

organisme niveau

Histologie als academische discipline, omvat de volgende secties: cytologie, embryologie, algemene histologie (bestudeert de structuur en functies van weefsels), speciale histologie (bestudeert de microscopische structuur van organen).

Hoofdobject De studie van histologie is het lichaam van een gezond persoon en daarom wordt deze academische discipline menselijke histologie genoemd.

De belangrijkste taak histologie bestaat uit het bestuderen van de structuur van cellen, weefsels en organen, het leggen van verbanden tussen verschillende verschijnselen en het vaststellen van algemene patronen.

Histologie behoort, net als anatomie, tot de morfologische wetenschappen, waarvan de hoofdtaak de studie van de structuren van levende systemen is. In tegenstelling tot anatomie bestudeert histologie de structuur van levende materie op microscopisch en elektronenmicroscopisch niveau. Tegelijkertijd wordt momenteel de studie van de structuur van verschillende structurele elementen uitgevoerd, rekening houdend met de functies die ze vervullen. Deze benadering van de studie van de structuren van levende materie wordt histofysiologisch genoemd, en histologie wordt vaak aangeduid als histofysiologie. Bovendien wordt bij het bestuderen van levende materie op cellulair, weefsel- en orgaanniveau niet alleen rekening gehouden met de vorm, grootte en locatie van de structuren van belang, maar wordt de samenstelling van de stoffen die deze structuren vormen vaak bepaald door de methode van cyto- en histochemie. Ten slotte worden de onderzochte structuren gewoonlijk beschouwd rekening houdend met hun ontwikkeling, zowel in de prenatale (embryonale) periode als tijdens de post-embryonale ontogenese. Dit is precies de reden waarom de noodzaak om embryologie op te nemen in de cursus histologie samenhangt.

Histologie heeft, net als elke andere wetenschap, zijn eigen wetenschap objecten en methoden hun studie. Het directe onderzoeksobject zijn cellen, fragmenten van weefsels en organen, die op een speciale manier zijn geprepareerd om ze onder een microscoop te bestuderen.

2. Studieobjecten zijn verdeeld in:

levend (cellen in een druppel bloed, cellen in kweek, enz.);

dood of gefixeerd, die afkomstig kunnen zijn van een levend organisme (biopsie) of van kadavers.

In ieder geval worden ze na het nemen van de stukken blootgesteld aan fixeeroplossingen of bevriezing. Vaste objecten worden zowel voor wetenschappelijke als educatieve doeleinden gebruikt. Preparaten die op een bepaalde manier zijn bereid en die worden gebruikt voor onderzoek onder een microscoop, worden histologische preparaten genoemd.

Histologisch exemplaar kan de vorm hebben:

een dun, gekleurd deel van een orgaan of weefsel;

uitstrijkje op glas;

afdruk op glas van een kapot orgel;

voorbereiding van dunne films.

Een histologisch monster van welke vorm dan ook moet aan de volgende eisen voldoen:

het in stand houden van de levensduur van structuren;

dun en transparant genoeg zijn om onder een microscoop in doorvallend licht te worden onderzocht;

contrastrijk zijn, dat wil zeggen dat de onderzochte structuren duidelijk zichtbaar moeten zijn onder een microscoop;

preparaten voor lichtmicroscopie moeten lange tijd worden bewaard en voor herhaald onderzoek worden gebruikt.

Deze vereisten worden bereikt tijdens de bereiding van het medicijn.

3. Er wordt onderscheid gemaakt tussen: stadia van het voorbereiden van een histologisch monster

Materiaal meenemen(een stukje weefsel of orgaan) voor het bereiden van het medicijn. Er wordt rekening gehouden met de volgende punten: het verzamelen van materiaal moet zo snel mogelijk na de dood of slachting van het dier worden uitgevoerd, en indien mogelijk van een levend object (biopsie), zodat de structuren van de cel, weefsel of orgaan wordt beter bewaard; het verzamelen van stukken moet gebeuren met een scherp instrument om het weefsel niet te beschadigen; de dikte van het stuk mag niet groter zijn dan 5 mm, zodat de bevestigingsoplossing in de dikte van het stuk kan doordringen; Het stuk moet gemarkeerd zijn (vermeld de naam van het orgel, het nummer van het dier of de naam van de persoon, de datum van verzameling, enzovoort).

Het materiaal bevestigen noodzakelijk om metabolische processen te stoppen en structuren te beschermen tegen verval. Fixatie wordt meestal bereikt door het stuk onder te dompelen in fixeervloeistoffen, zoals eenvoudige alcoholen en formaline en complexe Carnoy's oplossing, Zinker's fixeermiddel en andere. Het fixeermiddel veroorzaakt denaturatie van het eiwit en stopt daardoor metabolische processen en behoudt de structuren in hun levensduur. Fixatie kan ook worden bereikt door bevriezing (koeling in een CO2-stroom, vloeibare stikstof, enz.). De duur van de fixatie wordt voor elk weefsel of orgaan empirisch gekozen.

Stukken in afdichtingsmedia gieten(paraffine, celloïdine, harsen) of invriezen voor de daaropvolgende productie van dunne coupes.

Voorbereiding van secties op speciale instrumenten (microtoom of ultramicrotoom) met behulp van speciale messen. Secties voor lichtmicroscopie worden op glasplaatjes gelijmd en voor elektronenmicroscopie worden ze op speciale roosters gemonteerd.

Kleuring van secties of ze contrasteren (voor elektronenmicroscopie). Voordat de coupes worden gekleurd, wordt het afdichtingsmedium verwijderd (ontwassen). Het contrast van de bestudeerde structuren wordt bereikt door te kleuren. Kleurstoffen zijn onderverdeeld in basisch, zuur en neutraal. De meest gebruikte kleurstoffen zijn basisch (meestal hematoxyline) en zuur (eosine). Er worden vaak complexe kleurstoffen gebruikt.

Secties opruimen(in xyleen, tolueen), inkapseling in harsen (balsem, polystyreen), afdekken met een dekglaasje.

Na deze opeenvolgende procedures kan het medicijn onder een lichtmicroscoop worden bestudeerd.

Voor elektronenmicroscopiedoeleinden Er zijn enkele bijzonderheden in de voorbereidingsfasen, maar de algemene principes zijn hetzelfde. Het belangrijkste verschil is dat het histologische preparaat voor lichtmicroscopie lange tijd kan worden bewaard en hergebruikt. Secties voor elektronenmicroscopie worden eenmalig gebruikt. In dit geval worden eerst de interessante objecten in het medicijn gefotografeerd en worden de structuren bestudeerd met behulp van elektronendiffractiepatronen.

Gemaakt van stoffen met een vloeibare consistentie(bloed, beenmerg en andere) preparaten worden gemaakt in de vorm van een uitstrijkje op een glasplaatje, die ook worden gefixeerd, gekleurd en vervolgens bestudeerd.

Van fragiele parenchymale organen(lever, nier en andere) preparaten worden gemaakt in de vorm van een afdruk van het orgaan: na een breuk of breuk van het orgaan wordt een glasplaatje op de plaats van de orgaanbreuk aangebracht, waarop enkele vrije cellen worden gelijmd. Vervolgens wordt het preparaat gefixeerd, gekleurd en onderzocht.

Tenslotte uit enkele orgels(mesenterium, pia mater) of uit los vezelig bindweefsel, filmpreparaties worden gemaakt door uitrekken of pletten tussen twee glazen, ook met daaropvolgende fixatie, kleuren en gieten in harsen.

4. Belangrijkste onderzoeksmethode biologische objecten die in de histologie worden gebruikt, zijn dat wel microscopie dat wil zeggen het bestuderen van histologische preparaten met behulp van een microscoop. Microscopie kan een onafhankelijke onderzoeksmethode zijn, maar wordt de laatste tijd meestal gecombineerd met andere methoden (histochemie, historadiografie en andere). Er moet aan worden herinnerd dat voor microscopie verschillende microscoopontwerpen worden gebruikt, waardoor men verschillende parameters van de te bestuderen objecten kan bestuderen. Er wordt onderscheid gemaakt tussen: soorten microscopie:

lichtmicroscopie (resolutie 0,2 µm) het meest voorkomende type microscopie;

ultraviolette microscopie (resolutie 0,1 micron);

luminescerende (fluorescerende) microscopie om chemische stoffen in de betreffende structuren te bepalen;

fasecontrastmicroscopie voor het bestuderen van structuren in ongekleurde histologische preparaten;

polarisatiemicroscopie om voornamelijk vezelachtige structuren te bestuderen;

donkerveldmicroscopie voor het bestuderen van levende voorwerpen;

invallend lichtmicroscopie voor het bestuderen van dikke voorwerpen;

elektronenmicroscopie (resolutie tot 0,1-0,7 nm), de twee varianten transmissie (transmissie) elektronenmicroscopie en scanning of rastermicroscopie geven een beeld van het oppervlak van ultrastructuren.

Histochemische en cytochemische methoden Hiermee kunt u de samenstelling van chemische stoffen en zelfs hun hoeveelheid in de onderzochte structuren bepalen. De methode is gebaseerd op het uitvoeren van chemische reacties met het gebruikte reagens en de in het substraat aanwezige chemicaliën, waarbij een reactieproduct ontstaat (contrast of fluorescerend), dat vervolgens wordt bepaald door middel van licht- of fluorescentiemicroscopie.

Histoautoradiografie-methode maakt het mogelijk om de samenstelling van chemische stoffen in structuren en de intensiteit van de uitwisseling te identificeren op basis van de opname van radioactieve isotopen in de onderzochte structuren. De methode wordt het meest gebruikt in dierproeven.

Differentiële centrifugatiemethode Hiermee kunt u individuele organellen of zelfs fragmenten bestuderen die uit een cel zijn geïsoleerd. Om dit te doen, wordt een stuk van het onderzochte orgaan vermalen, gevuld met een fysiologische oplossing en vervolgens versneld in een centrifuge met verschillende snelheden (van 2 tot 150 duizend) en worden de gewenste fracties verkregen, die vervolgens op verschillende manieren worden bestudeerd. .

Interferometrie methode Hiermee kunt u de droge massa van stoffen in levende of vaste voorwerpen bepalen.

Immunomorfologische methoden maakt het mogelijk om, met behulp van vooraf uitgevoerde immuunreacties, gebaseerd op antigeen-antilichaaminteractie, subpopulaties van lymfocyten te bepalen, de mate van vreemdheid van cellen te bepalen, histologische typering van weefsels en organen uit te voeren (histocompatibiliteit te bepalen) voor orgaantransplantatie.

Celkweekmethode(in vitro, in vivo) cellen in een reageerbuis of in speciale capsules in het lichaam laten groeien en vervolgens levende cellen onder een microscoop bestuderen.

Meeteenheden gebruikt in de histologie

Voor het meten van structuren bij lichtmicroscopie worden vooral micrometers gebruikt: 1 µm is 0,001 mm; Elektronenmicroscopie maakt gebruik van nanometers: 1 nm is 0,001 micron.

5. IN geschiedenis van de ontwikkeling van de histologie voorwaardelijk er zijn er drie periode:

Pre-microscopische periode(van de 4e eeuw voor Christus tot 1665) wordt geassocieerd met de namen van Aristoteles, Galenus, Avicenna, Vesalius, Fallopius en wordt gekenmerkt door pogingen om heterogene weefsels (hard, zacht, vloeibaar, enz.) in het lichaam van dieren en mensen te isoleren en het gebruik van anatomische preparatiemethoden.

Microscopische periode(van 1665 tot 1950). Het begin van de periode wordt geassocieerd met de naam van de Engelse natuurkundige Robert Hooke, die ten eerste de microscoop verbeterde (er wordt aangenomen dat de eerste microscopen helemaal aan het begin van de 17e eeuw werden uitgevonden) en ten tweede deze gebruikte voor de systematische studie van verschillende objecten, inclusief biologische, en publiceerde de resultaten van deze observaties in 1665 in het boek "Micrography", ten derde introduceerde hij voor het eerst de term "cel" ("cellulum"). Vervolgens werden microscopen voortdurend verbeterd en steeds vaker gebruikt voor de studie van biologische weefsels en organen.

Bijzondere aandacht werd besteed aan het bestuderen van de structuur van de cel. Jan Purkinje beschreef de aanwezigheid van “protoplasma” (cytoplasma) en een kern in dierlijke cellen, en even later bevestigde R. Brown de aanwezigheid van een kern in de meeste dierlijke cellen. De botanicus M. Schleiden raakte geïnteresseerd in de oorsprong van cellen door cytokenese. Dankzij de resultaten van deze onderzoeken kon T. Schwan, op basis van hun rapporten, de celtheorie (1838-1839) formuleren in de vorm van drie postulaten:

alle plantaardige en dierlijke organismen bestaan ​​uit cellen;

alle cellen ontwikkelen zich volgens het algemene principe uit het cytoblastema;

Elke cel heeft een onafhankelijke vitale activiteit, en de vitale activiteit van het lichaam is de som van de activiteiten van de cellen.

R. Virchow (1858) maakte echter al snel duidelijk dat celontwikkeling wordt uitgevoerd door de oorspronkelijke cel (elke cel van een cel) te delen. De bepalingen van de door T. Schwan ontwikkelde celtheorie zijn nog steeds relevant, hoewel ze anders zijn geformuleerd.

Moderne bepalingen van celtheorie:

een cel is de kleinste eenheid van levende wezens;

de cellen van dierlijke organismen zijn qua structuur vergelijkbaar;

celreproductie vindt plaats door de oorspronkelijke cel te delen;

meercellige organismen zijn complexe ensembles van cellen en hun derivaten, verenigd in systemen van weefsels en organen, onderling verbonden door cellulaire, humorale en neurale vormen van regulatie.

Verdere verbetering van microscopen, vooral de creatie van achromatische lenzen, maakte het mogelijk kleinere structuren in cellen te identificeren:

cellencentrum Hertwig, 1875;

reticulair apparaat of lamellair complex van Golgi, 1898;

Bend's mitochondriën, 1898

Modern podium De ontwikkeling van de histologie begint in 1950 met het begin van het gebruik van de elektronenmicroscoop om biologische objecten te bestuderen, hoewel de elektronenmicroscoop al eerder werd uitgevonden (E. Ruska, M. Knoll, 1931). Het moderne ontwikkelingsstadium van de histologie wordt echter gekenmerkt door de introductie van niet alleen de elektronenmicroscoop, maar ook andere methoden: cyto- en histochemie, historadiografie en andere moderne methoden die hierboven zijn vermeld. In dit geval wordt meestal een complex van verschillende technieken gebruikt, waardoor men niet alleen een kwalitatief idee kan vormen van de structuren die worden bestudeerd, maar ook nauwkeurige kwantitatieve kenmerken kan verkrijgen. Verschillende morfometrische technieken worden momenteel bijzonder veel gebruikt, waaronder geautomatiseerde systemen voor het verwerken van ontvangen informatie met behulp van computers.

COLLEGE 2. Cytologie. Cytoplasma

Voor de vooruitgang van histologie, cytologie en embryologie, de introductie van prestaties in de natuurkunde en scheikunde, zijn nieuwe methoden van aanverwante wetenschappen - biochemie, moleculaire biologie, genetische manipulatie - van groot belang.

Moderne onderzoeksmethoden maken het mogelijk om weefsels niet alleen als één geheel te bestuderen, maar ook om individuele celtypen daaruit te isoleren om hun levensactiviteit over een lange periode te bestuderen, om individuele cellulaire organellen en hun samenstellende macromoleculen te isoleren (bijvoorbeeld DNA) en om hun functionele kenmerken te bestuderen.

Dergelijke mogelijkheden zijn ontstaan ​​in verband met de creatie van nieuwe instrumenten en technologieën - verschillende soorten microscopen, computertechnologie, structurele röntgenanalyse, het gebruik van nucleaire magnetische resonantie (NMR), radioactieve isotopen en autoradiografie, elektroforese en chromatografie, fractionering van celinhoud met behulp van ultracentrifugatie, scheiding en cultivering van cellen, productie van hybriden; gebruik van biotechnologische methoden - productie van hybridoma's en monoklonale antilichamen, recombinant DNA, enz.

Zo kunnen biologische objecten worden bestudeerd op weefsel-, cellulair, subcellulair en moleculair niveau. Ondanks de introductie in de natuurwetenschappen van een verscheidenheid aan biochemische, biofysische, fysische en technologische methoden die nodig zijn om veel problemen op te lossen die verband houden met het leven van cellen en weefsels, blijft histologie fundamenteel een morfologische wetenschap met haar eigen reeks methoden. Deze laatste maken het mogelijk om de processen die plaatsvinden in cellen en weefsels en hun structurele kenmerken te karakteriseren.

De belangrijkste fasen van cytologische en histologische analyse zijn de selectie van een studieobject, de voorbereiding ervan voor onderzoek onder een microscoop, het gebruik van microscopiemethoden en kwalitatieve en kwantitatieve beeldanalyse.

De onderzoeksobjecten zijn levende en gefixeerde cellen en weefsels, waarvan de beelden zijn verkregen met licht- en elektronenmicroscopen of op een televisiescherm. Er zijn een aantal methoden waarmee u deze objecten kunt analyseren.

Methoden voor microscopie van histologische preparaten

De belangrijkste methoden voor het bestuderen van biologische micro-objecten zijn licht- en elektronenmicroscopie, die veel worden gebruikt in de experimentele en klinische praktijk.

Microscopie is de belangrijkste methode voor het bestuderen van microobjecten en wordt al meer dan 300 jaar in de biologie gebruikt. Sinds de creatie en het gebruik van de eerste microscopen zijn ze voortdurend verbeterd. Moderne microscopen zijn een verscheidenheid aan complexe optische systemen met een hoge resolutie. De grootte van de kleinste structuur die in een microscoop te zien is, wordt bepaald door de kleinst oplosbare afstand (d o ), die vooral afhangt van de golflengte van het licht (\) en golflengten van elektromagnetische oscillaties van de elektronenstroom, enz. Deze afhankelijkheid wordt bij benadering bepaald door de formule d 0 = 1 / 2 \. Dus hoe korter de golflengte, hoe kleiner de opgeloste afstand en hoe kleiner de microstructuren te zien zijn in de preparatie. Voor het bestuderen van histologische preparaten worden verschillende soorten lichtmicroscopen en elektronenmicroscopen gebruikt.

Rijst. 1. Microscopen voor biologisch onderzoek.

A - licht biologische microscoop "Biolam-S": 1 - basis; 2 - buishouder; 3 - hellende buis; 4 - oculair, 5 - revolver; 6 - lenzen; 7 - tafel; 8 - condensor met een irisdiafragma; 9 - condensorschroef; 10 - spiegel; 11 - micrometrische schroef; 12 - macrometrische schroef. B - elektronenmicroscoop EMV-100AK met een geautomatiseerd beeldverwerkingssysteem: 1 - microscoopkolom (met een elektronenoptisch systeem en een monsterkamer); 2 - bedieningspaneel; 3 - camera met lichtgevend scherm; 4 - beeldanalyse-eenheid; 5 - videosignaalsensor.

Lichtmicroscopie. Om histologische microobjecten te bestuderen, worden conventionele lichtmicroscopen en hun varianten gebruikt, die lichtbronnen met verschillende golflengten gebruiken. Bij conventionele lichtmicroscopen is de verlichtingsbron natuurlijk of kunstlicht (Fig. 1, A). De minimale golflengte van het zichtbare deel van het spectrum is ongeveer 0,4 µm. Voor een conventionele lichtmicroscoop dus de kleinste resolutieafstand is ongeveer 0,2 µm ( Doen = "/,- 0,4 µm = 0,2 µm), en de totale vergroting (het product van de objectiefvergroting en de oculairvergroting) kan 1500-2500 zijn.

Zo kun je in een lichtmicroscoop niet alleen individuele cellen zien, variërend in grootte van 4 tot 150 micron, maar ook hun intracellulaire structuren - organellen, insluitsels. Om het contrast van micro-objecten te vergroten, wordt hun kleur gebruikt.

Ultraviolette microscopie. Dit is een soort lichtmicroscopie. Een ultraviolette microscoop maakt gebruik van kortere ultraviolette stralen met een golflengte van ongeveer 0,2 micron. De opgeloste afstand is hier 2 keer kleiner dan bij conventionele lichtmicroscopen, en bedraagt ​​ongeveer 0,1 μm (d o = V 2 - 0,2 μm = 0,1 μm). Een beeld dat onzichtbaar is voor het oog, verkregen door ultraviolette straling, wordt omgezet in een zichtbaar beeld door opname op een fotografische plaat of door gebruik te maken van speciale apparaten (fluorescerend scherm, elektron-optische omzetter).

Fluorescentie (luminescentie) microscopie. Het fenomeen van fluorescentie bestaat uit het feit dat atomen en moleculen van een aantal stoffen, die kortegolfstralen absorberen, in een aangeslagen toestand terechtkomen. De omgekeerde overgang van de aangeslagen toestand naar de normale toestand vindt plaats bij de emissie van licht, maar met een langere golflengte. In een fluorescentiemicroscoop worden ultrahogedrukkwik- of xenonlampen gebruikt als lichtbronnen om fluorescentie op te wekken, die een hoge helderheid hebben in het spectrale gebied van 0,25-0,4 μm (bijna-ultraviolette stralen) en 0,4-0,5 μm (blauwviolette stralen ).stralen). De golflengte van fluorescentielicht is altijd groter dan de golflengte van opwindend licht, dus worden ze gescheiden met behulp van lichtfilters en wordt het beeld van het object alleen bestudeerd in fluorescentielicht. Er wordt onderscheid gemaakt tussen intrinsieke, of primaire, en geïnduceerde, of secundaire, fluorescentie. Elke cel van een levend organisme heeft zijn eigen fluorescentie, maar deze is vaak extreem zwak.

Primaire fluorescentie wordt vertoond door serotonine, catecholamines (adrenaline, noradrenaline), aanwezig in zenuw-, mast- en andere cellen, na weefselfixatie in formaldehydedamp bij 60-80 °C (Falck-methode).

Secundaire fluorescentie treedt op wanneer geneesmiddelen worden verwerkt met speciale kleurstoffen - fluorochromen.

Er zijn verschillende fluorochromen die specifiek binden aan bepaalde macromoleculen (acridine-sinaasappel, rhodamine, fluoresceïne, enz.). Acridine-oranje fluorochroom wordt bijvoorbeeld het vaakst gebruikt bij de verwerking van medicijnen. In dit geval zijn het DNA en de verbindingen ervan in de cellen heldergroen RNA en zijn derivaten - een felrode gloed. De spectrale samenstelling van de straling bevat dus informatie over de interne structuur van het object en de chemische samenstelling ervan. Een variant van de fluorescentiemicroscopiemethode, waarbij zowel excitatie als emissie van fluorescentie plaatsvindt in het ultraviolette gebied van het spectrum, wordt de methode genoemd ultraviolette fluorescentiemicroscopie.

Fasecontrastmicroscopie. Deze methode wordt gebruikt om contrastbeelden te verkrijgen van transparante en kleurloze levende objecten die onzichtbaar zijn met conventionele microscopiemethoden. Zoals reeds aangegeven wordt in een conventionele lichtmicroscoop het noodzakelijke contrast van structuren bereikt door kleuring. De fasecontrastmethode biedt contrast met de bestudeerde ongeverfde structuren dankzij een speciaal ringvormig diafragma in de condensor en de zogenaamde faseplaat in de lens. Dit ontwerp van de microscoopoptiek maakt het mogelijk om faseveranderingen van licht dat door een ongekleurd preparaat gaat en die niet door het oog worden waargenomen, om te zetten in een verandering in de amplitude ervan, d.w.z. helderheid van het resulterende beeld. Door het contrast te vergroten, kunt u alle structuren zien die qua brekingsindex verschillen. Een variatie op de fasecontrastmethode is de methode fase-donkerveldcontrast, wat een negatief versus positief fasecontrastbeeld oplevert.

Donkerveldmicroscopie. In een donkerveldmicroscoop bereikt alleen het licht dat diffractie van structuren in het preparaat veroorzaakt het objectief. Dit gebeurt door de aanwezigheid van een speciale condensor in de microscoop, die het preparaat met strikt schuin licht verlicht; De stralen van de illuminator worden vanaf de zijkant gericht. Het veld lijkt dus donker en kleine deeltjes in het preparaat reflecteren licht, dat vervolgens de lens binnendringt. De resolutie van deze microscoop kan niet beter zijn dan die van een helderveldmicroscoop, aangezien dezelfde golflengte wordt gebruikt. Maar hier wordt een groter contrast bereikt. Het wordt gebruikt voor het bestuderen van levende objecten, autoradiografische objecten, zoals zilverkorrels, die helder lijken in een donker veld. In de kliniek wordt het gebruikt om kristallen in de urine (urinezuur, oxalaten) te bestuderen, om spirocheten aan te tonen, in het bijzonder treponema pallidum, die syfilis veroorzaakt, enz.

Interferentiemicroscopie. Varianten van een fasecontrastmicroscoop zijn een interferentiemicroscoop, die is ontworpen om weefselmassa te kwantificeren, en een differentiële interferentiemicroscoop (met Nomarski-optiek), die specifiek wordt gebruikt om het oppervlaktereliëf van cellen en andere biologische objecten te bestuderen.

In een interferentiemicroscoop wordt een lichtbundel van een illuminator in twee stromen verdeeld: de ene gaat door het object en verandert de oscillatiefase, de tweede gaat voorbij het object. In de objectiefprisma's zijn beide bundels met elkaar verbonden en interfereren ze met elkaar. Als gevolg hiervan wordt een beeld geconstrueerd waarin delen van een micro-object met verschillende dikte en dichtheid verschillen in de mate van contrast. Bepaal na het kwantificeren van de veranderingen de concentratie en massa droge stof.

Fasecontrast- en interferentiemicroscopen maken het mogelijk levende cellen te bestuderen. Ze maken gebruik van het interferentie-effect dat optreedt wanneer twee sets golven samenkomen om een ​​beeld van microstructuren te creëren. Het voordeel van fasecontrast, interferentie en donkerveldmicroscopie is het vermogen om cellen te observeren in het proces van beweging en mitose. In dit geval kan celbeweging worden vastgelegd met behulp van time-lapse (frame-voor-frame) microfilming.

Polarisatiemicroscopie. Een polarisatiemicroscoop is een aanpassing van een lichtmicroscoop waarin twee polarisatiefilters zijn geïnstalleerd: de eerste (polarisator) tussen de lichtstraal en het object, en de tweede (analysator) tussen de objectieflens en het oog. Door het eerste filter gaat het licht slechts in één richting door, het tweede filter heeft een hoofdas die loodrecht op het eerste filter staat en laat geen licht door. Hierdoor ontstaat een donkerveldeffect. Beide filters kunnen roteren, waardoor de richting van de lichtbundel verandert. Als de analysator 90° wordt gedraaid ten opzichte van de polarisator, zal er geen licht doorheen gaan. Structuren die longitudinaal georiënteerde moleculen bevatten (collageen, microtubuli, microfilamenten) en kristallijne structuren (in Leydig-cellen 1) zien er lichtgevend uit als de rotatie-as verandert. Het vermogen van kristallen of parakristallijne formaties om een ​​lichtgolf te splitsen in een gewone golf en een golf die loodrecht daarop staat, wordt dubbele breking genoemd. De fibrillen van dwarsgestreepte spieren hebben dit vermogen.

Elektronenmicroscopie. Een grote stap voorwaarts in de ontwikkeling van microscopietechnologie was de creatie en het gebruik van een elektronenmicroscoop (zie figuur 1, B). Een elektronenmicroscoop maakt gebruik van een stroom elektronen met kortere golflengten dan een lichtmicroscoop. Bij een spanning van 50.000 V is de golflengte van elektromagnetische oscillaties die ontstaan ​​wanneer een stroom elektronen in een vacuüm beweegt 0,0056 nm. Theoretisch wordt berekend dat de opgeloste afstand onder deze omstandigheden ongeveer 0,002 nm kan zijn, of 0,000002 µm, d.w.z. 100.000 keer minder; dan in een lichtmicroscoop. In de praktijk bedraagt ​​de opgeloste afstand in moderne elektronenmicroscopen ongeveer 0,1-0,7 nm.

Momenteel worden transmissie- (transmissie)-elektronenmicroscopen (TEM) en scanning- (raster)-elektronenmicroscopen (SEM) veel gebruikt. Met TEM kunt u alleen een vlak beeld verkrijgen van het micro-object dat wordt bestudeerd. Om een ​​ruimtelijke weergave van structuren te verkrijgen, worden SEM’s gebruikt die in staat zijn een driedimensionaal beeld te creëren. Een scanning-elektronenmicroscoop werkt volgens het principe van het scannen van een object dat wordt bestudeerd met een elektronenmicrosonde, dat wil zeggen dat het achtereenvolgens individuele punten van het oppervlak ‘tast’ met een scherp gefocusseerde elektronenbundel. Om een ​​geselecteerd gebied te bestuderen, beweegt de microsonde zich langs het oppervlak ervan onder invloed van afbuigspoelen (televisiescanprincipe). Deze studie van een object wordt scannen (lezen) genoemd, en het patroon waarlangs de microsonde beweegt wordt een raster genoemd. Het resulterende beeld wordt weergegeven op een televisiescherm, waarvan de elektronenbundel synchroon met de microsonde beweegt.

De belangrijkste voordelen van scanning-elektronenmicroscopie zijn een grote scherptediepte, een breed scala aan continue veranderingen in vergroting (van tientallen tot tienduizenden keren) en een hoge resolutie.

Elektronenmicroscopie met behulp van de bevriezingsmethode- chippen gebruikt om de details van de structuur van membranen en intercellulaire verbindingen te bestuderen. Om chips te maken worden cellen op een lage temperatuur (-160 °C) ingevroren. Bij onderzoek van een membraan loopt het splitsingsvlak door het midden van de lipidedubbellaag. Vervolgens worden metalen (platina, palladium, uranium) op de binnenoppervlakken van de resulterende membraanhelften gespoten en bestudeerd met behulp van TEM en microfotografie.

Cryo-elektronenmicroscopiemethode. Een snel ingevroren dunne laag (ongeveer 100 nm) van een weefselmonster wordt op een microscopisch rooster geplaatst en onderzocht in een microscoopvacuüm bij -160 C.

Elektronenmicroscopiemethode "bevriezen"- etsen" gebruikt om het buitenoppervlak van celmembranen te bestuderen. Na het snel invriezen van de cellen op een zeer lage temperatuur wordt het blok met een mes gespleten. De resulterende ijskristallen worden verwijderd door water in een vacuüm te sublimeren. Vervolgens worden delen van de cellen gearceerd door een dunne film van een zwaar metaal (bijvoorbeeld platina) te sputteren. De methode maakt het mogelijk om de driedimensionale organisatie van structuren te identificeren.

Vries-splitsings- en vries-etsmethoden maken het dus mogelijk om niet-gefixeerde cellen te bestuderen zonder de vorming van artefacten veroorzaakt door fixatie.

Contrasterende methoden met zouten van zware metalen maken het mogelijk om individuele macromoleculen - DNA, grote eiwitten (bijvoorbeeld myosine) in een elektronenmicroscoop te onderzoeken. Met negatief contrast worden aggregaten van macromoleculen (ribosomen, virussen) of eiwitfilamenten (actinefilamenten) bestudeerd.

Elektronenmicroscopie van ultradunne coupes verkregen door cryo-ultramicrotomie. Bij deze methode worden stukjes weefsel zonder fixatie of inbedding in vaste media snel gekoeld in vloeibare stikstof bij een temperatuur van -196 °C. Dit zorgt voor remming van celstofwisselingsprocessen en de overgang van water van de vloeibare fase naar de vaste fase. Vervolgens worden de blokken gesneden met behulp van een ultramicrotoom bij lage temperatuur. Deze methode voor het bereiden van secties wordt meestal gebruikt om de enzymactiviteit te bepalen en om immunochemische reacties uit te voeren. Om antigenen te detecteren, worden antilichamen gebruikt die geassocieerd zijn met deeltjes colloïdaal goud, waarvan de lokalisatie gemakkelijk te identificeren is op preparaten.

Methoden voor ultrahoogspanningsmicroscopie. Er wordt gebruik gemaakt van elektronenmicroscopen met een versnellingsspanning tot 3.000.000 V. Het voordeel van deze microscopen is dat ze het mogelijk maken objecten met een grote dikte (1-10 micron) te bestuderen, omdat ze bij hoge elektronenenergieën minder door het object worden geabsorbeerd . Stereoscopische beeldvorming maakt het mogelijk informatie te verkrijgen over de driedimensionale organisatie van intracellulaire structuren met hoge resolutie (ongeveer 0,5 nm).

Röntgendiffractieanalyse. Om de structuur van macromoleculen op atomair niveau te bestuderen, worden methoden gebruikt waarbij röntgenstraling wordt gebruikt met een golflengte van ongeveer 0,1 nm (de diameter van een waterstofatoom). De moleculen die het kristalrooster vormen, worden bestudeerd met behulp van diffractiepatronen, die op een fotografische plaat worden vastgelegd in de vorm van vele vlekken met verschillende intensiteit. De intensiteit van de vlekken hangt af van het vermogen van verschillende objecten in de array om straling te verstrooien. De positie van de vlekken in het diffractiepatroon hangt af van de positie van het object in het systeem, en hun intensiteit geeft de interne atomaire structuur aan.

Methoden voor het bestuderen van vaste cellen en weefsels

Studie van vaste cellen en weefsels. Het hoofddoel van het onderzoek is histologische preparaten, vervaardigd uit vaste structuren. Het monster kan een uitstrijkje zijn (bijvoorbeeld een uitstrijkje van bloed, beenmerg, speeksel, hersenvocht, enz.), een afdruk (bijvoorbeeld milt, thymus, lever), een weefselfilm (bijvoorbeeld bindweefsel of weefsel). buikvlies, borstvlies, pia mater), dunne plak. Meestal wordt voor onderzoek een stukje weefsel of orgaan gebruikt. Histologische preparaten kunnen zonder speciale verwerking worden bestudeerd. Zo kan een geprepareerd bloeduitstrijkje, afdruk, film of orgaancoupe direct onder de microscoop worden onderzocht. Maar vanwege het feit dat de structuren een laag contrast hebben, zijn ze slecht zichtbaar in een conventionele lichtmicroscoop en is het gebruik van speciale microscopen (fasecontrast enz.) vereist, daarom worden vaker speciaal bewerkte preparaten gebruikt.

Het proces van het maken van een histologische voorbereiding voor licht- en elektronenmicroscopie omvat de volgende hoofdstappen: 1) het nemen van materiaal en het fixeren ervan, 2) het compacteren van het materiaal, 3) het voorbereiden van secties, 4) het kleuren of contrasteren van secties. Voor lichtmicroscopie is nog een stap vereist: het insluiten van secties in balsem of andere transparante media (5). Fixatie zorgt voor het voorkomen van ontbindingsprocessen, wat helpt de integriteit van structuren te behouden. Dit wordt bereikt door het feit dat een klein monster uit het orgel wordt ondergedompeld in een fixeermiddel (alcohol, formaldehyde, oplossingen van zouten van zware metalen, osminezuur, speciale fixeermengsels) of wordt onderworpen aan een warmtebehandeling. Onder invloed van het fixeermiddel treden complexe fysische en chemische veranderingen op in weefsels en organen. De belangrijkste daarvan is het proces van onomkeerbare coagulatie van eiwitten, waardoor de vitale activiteit stopt en de structuren dood en gefixeerd worden. Fixatie leidt tot verdichting en vermindering van het volume van de stukken, evenals tot een verbetering van de daaropvolgende kleuring van cellen en weefsels.

Verdichting van stukken nodig voor het voorbereiden van secties, wordt geproduceerd door eerder gedehydrateerd materiaal te impregneren met paraffine, celloïdine en organische harsen. Een snellere verdichting wordt bereikt door de methode te gebruiken waarbij de stukken worden ingevroren, bijvoorbeeld in vloeibaar kooldioxide.

Voorbereiding van secties geproduceerd op speciale apparaten - microtomen(voor lichtmicroscopie) en ultramicrotomen(voor elektronenmicroscopie).

Sectiekleuring(bij lichtmicroscopie) of ze besproeien met metaalzouten(bij elektronenmicroscopie) worden gebruikt om het contrast van het beeld van individuele structuren te vergroten wanneer ze onder een microscoop worden bekeken. Methoden voor het kleuren van histologische structuren zijn zeer divers en worden geselecteerd afhankelijk van de doelstellingen van het onderzoek. Histologische vlekken zijn onderverdeeld in zuur, basisch en neutraal. Een voorbeeld is de bekendste basische kleurstof, azuur II, die de kernen violet kleurt, en de zure kleurstof eosine, die het cytoplasma roze-oranje kleurt. De selectieve affiniteit van structuren voor bepaalde kleurstoffen wordt bepaald door hun chemische samenstelling en fysische eigenschappen. Structuren die goed kleuren met zure kleurstoffen worden genoemd oxyfiel(acidofilisch, eosinofiel) en degenen die gekleurd zijn met basische - basofiel. Structuren die zowel zure als basische kleurstoffen accepteren, zijn dat wel neutrofiel(heterofiel). Gekleurde preparaten worden gewoonlijk gedehydrateerd in alcoholen met toenemende sterkte en geklaard in xyleen, benzeen, tolueen of sommige oliën. Voor langdurige bewaring wordt het gedehydrateerde histologische gedeelte tussen een objectglaasje en een dekglas ingesloten in Canadese balsem of andere stoffen. Het voltooide histologische monster kan vele jaren worden gebruikt voor onderzoek onder een microscoop. Voor elektronenmicroscopie worden met een ultramicrotoom verkregen coupes op speciale roosters geplaatst, gecontrasteerd met zouten van mangaan, kobalt, etc., waarna ze onder een microscoop worden bekeken en gefotografeerd. De resulterende microfoto's dienen als studieobject samen met histologische preparaten.

Methoden voor het bestuderen van levende cellen en weefsels

De studie van levende cellen en weefsels stelt ons in staat de meest volledige informatie over hun levensactiviteit te verkrijgen - om de beweging, processen van deling, vernietiging, groei, differentiatie en interactie van cellen, de duur van hun levenscyclus, reactieve veranderingen als reactie hierop te volgen aan de werking van verschillende factoren.

Intravitaal onderzoek van cellen in het lichaam (inlevend). Eén van de intravitale onderzoeksmethoden is het observeren van structuren in een levend organisme. Met behulp van speciale transmissie-illuminatormicroscopen is het bijvoorbeeld mogelijk om de dynamiek van de bloedcirculatie in microvaatjes te bestuderen. Nadat de anesthesie aan het dier is toegediend, wordt het onderzoeksobject (bijvoorbeeld het darmmesenterium) naar buiten gebracht en onder een microscoop onderzocht, terwijl het weefsel constant moet worden bevochtigd met een isotone natriumchloride-oplossing. De duur van een dergelijke observatie is echter beperkt. De beste resultaten worden verkregen door transparante camera’s in het lichaam van het dier te implanteren.

Het handigste orgaan voor het implanteren van dergelijke camera's en daaropvolgende observatie is het oor van een dier (bijvoorbeeld een konijn). Een deel van het oor met een transparante kamer wordt op een microscooptafel geplaatst en onder deze omstandigheden wordt de dynamiek van veranderingen in cellen en weefsels over een lange periode bestudeerd. Op deze manier kunnen de processen van het uitdrijven van leukocyten uit bloedvaten, verschillende stadia van de vorming van bindweefsel, haarvaten, zenuwen en andere processen worden bestudeerd. Het oog van proefdieren kan worden gebruikt als een natuurlijke transparante camera. Cellen, weefsel of orgaanmonsters worden in de vloeistof van de voorste oogkamer geplaatst onder de hoek gevormd door het hoornvlies en de iris en kunnen door het heldere hoornvlies worden bekeken. Op deze manier werd een bevruchte eicel getransplanteerd en werden de vroege stadia van de embryo-ontwikkeling getraceerd. Kleine stukjes van de baarmoeder werden bij apen getransplanteerd en veranderingen in het baarmoederslijmvlies tijdens verschillende fasen van de menstruatiecyclus werden bestudeerd.

De methode voor het transplanteren van bloedcellen en beenmerg van gezonde donordieren naar ontvangende dieren die zijn blootgesteld aan dodelijke straling, wordt op grote schaal gebruikt. Ontvangende dieren bleven na transplantatie in leven dankzij de transplantatie van donorcellen, die kolonies van hematopoietische cellen in de milt vormden. Het bestuderen van het aantal kolonies en hun cellulaire samenstelling maakt het mogelijk om het aantal ouderlijke hematopoëtische cellen en de verschillende stadia van hun differentiatie te identificeren. Met behulp van de kolonievormingsmethode zijn de bronnen van ontwikkeling voor alle bloedcellen geïdentificeerd.

Vitale en supravitale kleuring. Bij vitale (intravitale) kleuring van cellen en weefsels wordt de kleurstof in het lichaam van het dier gebracht en kleurt deze selectief bepaalde cellen, hun organellen of intercellulaire substantie. Fagocyten worden bijvoorbeeld gedetecteerd met behulp van trypaanblauw of lithiumkarmijn, en nieuw gevormde botmatrix wordt gedetecteerd met behulp van alizarine.

Supravitale kleuring is de kleuring van levende cellen die uit het lichaam zijn geïsoleerd. Op deze manier worden jonge vormen van erytrocyten geïdentificeerd - bloedreticulocyten (kleurstof briljant cresylblauw), mitochondriën in cellen (kleurstof Janus groen), lysosomen (kleurstof neutraal rood).

Studies van levende cellen en weefsels in cultuur (invitro). Deze methode is een van de meest voorkomende. Cellen, kleine weefselmonsters of organen geïsoleerd uit het menselijk of dierlijk lichaam worden in glazen of plastic vaten geplaatst die een speciaal voedingsmedium bevatten: bloedplasma, embryonaal extract en kunstmatige media. Er zijn suspensieculturen (cellen gesuspendeerd in een medium), weefsel-, orgaan- en monolaagculturen (geëxplanteerde cellen vormen een doorlopende laag op het glas). De steriliteit van de omgeving en de temperatuur die overeenkomt met de lichaamstemperatuur zijn gegarandeerd. Onder deze omstandigheden behouden cellen lange tijd fundamentele vitale functies: het vermogen om te groeien, zich voort te planten, te differentiëren en te bewegen. Dergelijke culturen kunnen vele dagen, maanden en zelfs jaren blijven bestaan ​​als het kweekmedium wordt bijgewerkt en levensvatbare cellen in andere vaten worden getransplanteerd. Sommige soorten cellen kunnen, als gevolg van veranderingen in hun genoom, overleven en zich in cultuur vermenigvuldigen, waardoor continue cellijnen worden gevormd. A. A. Maksimov, A. V. Rumyantsev, N. G. Khlopin, A. D. Timofeevsky, F. M. Lazarenko hebben een grote bijdrage geleverd aan de ontwikkeling van methoden voor het kweken van cellen en weefsels. Momenteel zijn cellijnen van fibroblasten, myocyten, epitheelcellen, macrofagen, enz. verkregen, die al vele jaren bestaan.

Het gebruik van de kweekmethode maakte het mogelijk een aantal differentiatiepatronen, kwaadaardige degeneratie van cellen, cellulaire interacties en interacties van cellen met virussen en microben te identificeren. Het vermogen van kraakbeencellen om intercellulaire substanties in kweek te vormen en het vermogen van bijniercellen om hormonen te produceren zijn aangetoond. Door het kweken van embryonale weefsels en organen werd het mogelijk de ontwikkeling van botten, huid en andere organen te volgen. Er is een techniek ontwikkeld voor het kweken van zenuwcellen.

De weefselkweekmethode is van bijzonder belang voor het uitvoeren van experimentele observaties op menselijke cellen en weefsels. Cellen die bij een punctie of biopsie uit het menselijk lichaam worden genomen, kunnen in weefselkweek worden gebruikt om het geslacht, erfelijke ziekten, kwaadaardige degeneratie en de effecten van een aantal giftige stoffen in kaart te brengen.

De afgelopen jaren zijn celculturen op grote schaal gebruikt voor celhybridisatie.

Er zijn methoden ontwikkeld om weefsels in cellen te verdelen, individuele celtypen te isoleren en te kweken.

Eerst wordt het weefsel omgezet in een celsuspensie door de intercellulaire contacten en de intercellulaire matrix te vernietigen met behulp van proteolytische enzymen (trypsine, collagenase) en Ca2+-bindende verbindingen (met behulp van EDTA - ethyleendiaminetetra-azijnzuur). Vervolgens wordt de resulterende suspensie verdeeld in fracties van verschillende typen cellen met behulp van centrifugatie, wat het mogelijk maakt om zwaardere cellen te scheiden van lichte, grote van kleine, of door cellen aan glas of plastic te hechten, waarvan het vermogen varieert per cel. verschillende soorten cellen. Om specifieke hechting van cellen aan het glasoppervlak te garanderen, worden antilichamen gebruikt die specifiek binden aan cellen van één type. Hechtende cellen worden vervolgens gescheiden door de matrix met enzymen te vernietigen, wat resulteert in een suspensie van homogene cellen. Een subtielere methode voor celscheiding is het labelen met antilichamen geassocieerd met fluorescerende kleurstoffen. Gelabelde cellen worden gescheiden van niet-gelabelde cellen met behulp van een sorter (elektronische fluorescentie-geactiveerde celanalysator). De celanalysator sorteert ongeveer 5000 cellen in 1. Geïsoleerde cellen kunnen onder kweekomstandigheden worden bestudeerd.

De methode van het kweken van cellen maakt het mogelijk om hun vitale activiteit, voortplanting, differentiatie, interactie met andere cellen, de invloed van hormonen, groeifactoren, enz. te bestuderen.

Culturen worden gewoonlijk bereid uit een celsuspensie verkregen door de hierboven beschreven weefseldissociatiemethode. De meeste cellen kunnen niet in suspensie groeien; ze hebben een stevig oppervlak nodig, dat is het oppervlak van een plastic kweekschaaltje, soms met extracellulaire matrixcomponenten, zoals collageen. Primaire gewassen verwijst naar culturen die onmiddellijk na de eerste fase van celfractionering zijn bereid, ondergeschikt- celculturen getransplanteerd uit primaire culturen naar een nieuw medium. Cellen kunnen achtereenvolgens worden getransplanteerd gedurende een periode van weken of maanden, waarbij de cellen hun karakteristieke kenmerken van differentiatie behouden (bijvoorbeeld epitheelcellen die lagen vormen). Het uitgangsmateriaal voor celculturen zijn meestal foetale en neonatale weefsels.

Als voedingsmedia worden mengsels van zouten, aminozuren, vitaminen, paardenserum, kippenembryo-extract, foetaal serum etc. gebruikt. Voor het kweken van verschillende soorten cellen zijn inmiddels speciale media ontwikkeld. Ze bevatten een of meer eiwitgroeifactoren die nodig zijn om cellen te laten functioneren en zich voort te planten. Voor de groei van zenuwcellen is bijvoorbeeld zenuwgroeifactor (NGF) nodig.

De meeste cellen in kweek ondergaan een bepaald aantal delingen (50-100) en sterven vervolgens. Soms verschijnen er mutante cellen in de cultuur, die zich eindeloos vermenigvuldigen en een cellijn vormen (fibroblasten, epitheelcellen, myoblasten, enz.). Mutante cellen verschillen van kankercellen, die ook in staat zijn tot continue deling, maar kunnen groeien zonder zich aan een vast oppervlak te hechten. Kankercellen in kweekschalen vormen een dichtere populatie dan populaties normale cellen. Een vergelijkbare eigenschap kan experimenteel in normale cellen worden geïnduceerd door ze te transformeren met van tumoren afgeleide virussen of chemische verbindingen, wat resulteert in de vorming van neoplastisch getransformeerde cellijnen. Cellijnen van niet-getransformeerde en getransformeerde cellen kunnen bij lage temperaturen (-70 ° C) lange tijd worden bewaard. De genetische homogeniteit van cellen wordt versterkt door klonen, wanneer uit één cel tijdens de opeenvolgende deling een grote kolonie homogene cellen wordt verkregen. Een kloon is een populatie cellen die zijn afgeleid van een enkele voorlopercel.

Cel-hybriden. Wanneer twee cellen van verschillende typen samensmelten, wordt een heterokaryon gevormd: een cel met twee kernen. Om een ​​heterokaryon te verkrijgen wordt een celsuspensie behandeld met polyethyleenglycol of geïnactiveerde virussen om de plasmamembranen van de cellen te beschadigen, waarna de cellen in staat zijn tot fusie. De inactieve kern van een kippenerytrocyt wordt bijvoorbeeld actief (RNA-synthese, DNA-replicatie) na celfusie en overdracht naar het cytoplasma van een andere cel die in weefselkweek groeit. Het heterokaryon is in staat tot mitose, resulterend in de formatie hybride cel. De schillen van de kernen van het heterokaryon worden vernietigd en hun chromosomen worden gecombineerd in één grote kern.

Het klonen van hybride cellen leidt tot de vorming van hybride cellijnen, die worden gebruikt voor genoomonderzoek. In een hybride cellijn van muis en mens werd bijvoorbeeld de rol van menselijk chromosoom 11 bij de insulinesynthese vastgesteld.

Hybridomen. Hybridomacellijnen worden gebruikt om monoklonale antilichamen te produceren. Antilichamen worden geproduceerd door plasmacellen, die tijdens immunisatie worden gevormd uit B-lymfocyten. Een bepaald type antilichaam wordt verkregen door muizen te immuniseren met specifieke antigenen. Als dergelijke geïmmuniseerde lymfocyten worden gekloond, kan een groot aantal homogene antilichamen worden verkregen. De levensduur van B-lymfocyten in kweek is echter beperkt. Daarom versmelten ze met ‘onsterfelijke’ tumorcellen (B-lymfomen). Als gevolg hiervan worden hybriden gevormd (hybride cel, met een genoom uit twee verschillende cellen; oma - eindigend op de namen van tumoren). Dergelijke hybridoma's zijn in staat zich lange tijd in kweek te vermenigvuldigen en antilichamen van een bepaald type te synthetiseren. Elke hybridomakloon is een bron van monoklonale antilichamen. Alle antilichaammoleculen van een bepaald type hebben dezelfde antigeenbindingsspecificiteit. Het is mogelijk om monoklonale antilichamen te verkrijgen tegen elk eiwit dat zich in een cel bevindt en deze te gebruiken om de lokalisatie van eiwitten in de cel te bepalen, en om eiwitten uit een mengsel te isoleren (eiwitzuivering), waardoor men de structuur en functie kan bestuderen van eiwitten. Monoklonale antilichamen worden ook gebruikt in de genkloneringstechnologie.

Antilichamen kunnen worden gebruikt om de functie van verschillende moleculen te bestuderen door ze via het plasmalemma rechtstreeks in het cytoplasma van cellen te introduceren met een dunne glazen pipet. Het introduceren van antilichamen tegen myosine in het cytoplasma van een bevrucht zee-egelei stopt bijvoorbeeld de deling van het cytoplasma.

Recombinant DNA-technologie. Klassieke genetische methoden maken het mogelijk de genfunctie te bestuderen door de fenotypes van mutante organismen en hun nakomelingen te analyseren. Recombinant-DNA-technologie vormt een aanvulling op deze methoden en maakt gedetailleerde chemische analyse van genetisch materiaal en de productie van cellulaire eiwitten in grote hoeveelheden mogelijk.

Hybridisatiemethoden worden in de moderne biologie veel gebruikt om de structuur van genen en hun expressie te bestuderen.

Methoden voor het bestuderen van de chemische samenstelling en het metabolisme van cellen en weefsels

Om de chemische samenstelling van biologische structuren te bestuderen - de lokalisatie van stoffen, hun concentratie en dynamiek in metabolische processen, worden speciale onderzoeksmethoden gebruikt.

Cyto- En histochemische methoden. Deze methoden maken het mogelijk om de lokalisatie van verschillende chemicaliën in de structuren van cellen, weefsels en organen te identificeren: DNA, RNA, eiwitten, koolhydraten, lipiden, aminozuren, mineralen, vitamines, enzymactiviteit. Deze methoden zijn gebaseerd op de specificiteit van de reactie tussen een chemisch reagens en een substraat dat deel uitmaakt van cel- en weefselstructuren, en de kleuring van de producten van chemische reacties. Om de specificiteit van de reactie te vergroten, wordt vaak enzymatische controle gebruikt. Om bijvoorbeeld ribonucleïnezuur (RNA) in cellen te detecteren, wordt vaak gallocyanine gebruikt, een kleurstof met basische eigenschappen, en de aanwezigheid RNA bevestigd door controlebehandeling met ribonuclease, dat RNA splitst. Gallocyaninevlekken RNA in blauwviolette kleur. Als de sectie wordt voorbehandeld met ribonuclease en vervolgens wordt gekleurd met gallocyanine, bevestigt de afwezigheid van kleuring de aanwezigheid van ribonucleïnezuur in de structuur. Beschrijvingen van talrijke cyto- en histochemische methoden worden gegeven in speciale handleidingen.

De afgelopen jaren heeft de combinatie van histochemische methoden met elektronenmicroscopie geleid tot de ontwikkeling van een nieuwe veelbelovende richting: elektronenhistochemie. Deze methode maakt het mogelijk om de lokalisatie van verschillende chemicaliën te bestuderen, niet alleen op cellulair, maar ook op subcellulair en moleculair niveau.

Om de macromoleculen van cellen te bestuderen, worden zeer gevoelige methoden gebruikt met behulp van radioactieve isotopen en antilichamen, die het mogelijk maken om zelfs een kleine hoeveelheid moleculen (minder dan 1000) te detecteren.

Radioactieve isotopen Wanneer kernen vervallen, zenden ze geladen deeltjes (elektronen) of straling (bijvoorbeeld gammastraling) uit, die met speciale instrumenten kunnen worden gedetecteerd. Bij de autoradiografiemethode worden radioactieve isotopen gebruikt. Met behulp van radio-isotopen van 3H-thymidine wordt bijvoorbeeld nucleair DNA bestudeerd, en RNA wordt bestudeerd met behulp van 3H-uridine.

Autoradiografie methode. Deze methode maakt het mogelijk om het metabolisme in verschillende structuren zo volledig mogelijk te bestuderen. De methode is gebaseerd op het gebruik van radioactieve elementen (bijvoorbeeld fosfor - 32 P, koolstof - 14 C, zwavel - 35 S, waterstof - 3 H) of daarmee gelabelde verbindingen. Radioactieve stoffen in histologische secties worden gedetecteerd met behulp van een fotografische emulsie, die op het preparaat wordt aangebracht en vervolgens wordt ontwikkeld. In gebieden van het medicijn waar de foto-emulsie in contact komt met een radioactieve stof, vindt een fotoreactie plaats, waardoor verlichte gebieden (sporen) worden gevormd. Deze methode kan worden gebruikt om bijvoorbeeld de snelheid van opname van gelabelde aminozuren in eiwitten, de vorming van nucleïnezuren, het jodiummetabolisme in schildkliercellen, enz. te bepalen.

Methoden voor immunofluorescentieanalyse. Toepassing van antilichamen. Antilichamen zijn beschermende eiwitten die door plasmacellen (derivaten van B-lymfocyten) worden geproduceerd als reactie op de werking van vreemde stoffen (antigenen). Het aantal verschillende vormen van antilichamen bereikt een miljoen. Elk antilichaam heeft plaatsen voor ‘herkenning’ van de moleculen die de synthese van dit antilichaam veroorzaakten. Vanwege de hoge specificiteit van antilichamen voor antigenen kunnen ze worden gebruikt om alle celeiwitten te detecteren. Om de lokalisatie van eiwitten zichtbaar te maken, worden antilichamen gekleurd met fluorescerende kleurstoffen en vervolgens worden de cellen onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie. Antilichamen kunnen ook worden gebruikt om antigenen op ultrastructureel niveau te bestuderen met behulp van een elektronenmicroscoop. Om dit te doen, worden antilichamen gelabeld met elektronendichte deeltjes (colloïdale goudmicrosferen). Om de specificiteit van de reactie te vergroten, worden monoklonale antilichamen gebruikt, gevormd door een cellijn - klonen verkregen door de hybridomamethode uit één cel. De hybridomamethode maakt het mogelijk monoklonale antilichamen te verkrijgen met dezelfde specificiteit en in onbeperkte hoeveelheden.

Immunofluorescente analysemethoden worden op grote schaal en effectief gebruikt in de moderne histologie. Deze methoden worden gebruikt om de processen van celdifferentiatie te bestuderen en specifieke chemische verbindingen en structuren daarin te identificeren. Ze zijn gebaseerd op antigeen-antilichaamreacties. Elke cel van het lichaam heeft een specifieke antigene samenstelling, die voornamelijk wordt bepaald door eiwitten. Reactieproducten kunnen worden gekleurd en gedetecteerd in een fluorescentiemicroscoop, bijvoorbeeld detectie van actine en tubuline in een cel met behulp van de immunofluorescentiemethode (zie Hoofdstuk IV).

Moderne onderzoeksmethoden maken het mogelijk om de chemische samenstelling van verschillende structurele componenten van cellen, zowel vaste als levende, te analyseren. De studie van individuele intracellulaire structuren werd mogelijk na de ontwikkeling van technologieën voor fractionering van cellulaire inhoud.

Fractionering van cellulaire inhoud

Celstructuren en macromoleculen kunnen worden gefractioneerd met behulp van verschillende methoden: ultracentrifugatie, chromatografie, elektroforese. Deze methoden worden gedetailleerder beschreven in biochemieleerboeken.

Ultracentrifugatie. Met deze methode kunnen cellen worden verdeeld in organellen en macromoleculen. Ten eerste worden cellen vernietigd door osmotische shock, ultrageluid of mechanische actie. In dit geval vallen de membranen (plasmolemma, endoplasmatisch reticulum) uiteen in fragmenten, waaruit kleine blaasjes worden gevormd, en blijven de kernen en organellen (mitochondria, Golgi-apparaat, lysosomen en peroxisomen) intact en bevinden zich in de vormende suspensie.

Om de bovengenoemde celcomponenten te scheiden, wordt een hogesnelheidscentrifuge (80.000-150.000 rpm) gebruikt. Eerst bezinken grotere delen (kernen, cytoskelet) op de bodem van de reageerbuis (sediment). Met een verdere toename van de centrifugatiesnelheid van bovenstaande fracties bezinken kleinere deeltjes achtereenvolgens - eerst mitochondriën, lysosomen en peroxisomen, dan microsomen en kleine blaasjes, en ten slotte ribosomen en grote macromoleculen. Tijdens het centrifugeren bezinken verschillende fracties met verschillende snelheden, waardoor afzonderlijke banden in de reageerbuis worden gevormd die kunnen worden geïsoleerd en onderzocht. Gefractioneerde celextracten (celvrije systemen) worden veel gebruikt om intracellulaire processen te bestuderen, bijvoorbeeld om de biosynthese van eiwitten te bestuderen, de genetische code te ontcijferen, enz.

Chromatografie wordt veel gebruikt voor eiwitfractionering.

Elektroforese maakt de scheiding mogelijk van eiwitmoleculen met verschillende ladingen door ze in waterige oplossingen (of in een vaste poreuze matrix) in een elektrisch veld te plaatsen.

De methoden van chromatografie en elektroforese worden gebruikt om peptiden te analyseren die zijn verkregen door het splitsen van een eiwitmolecuul en om zogenaamde peptidekaarten van eiwitten te verkrijgen. Deze methoden worden in detail beschreven in biochemieleerboeken.

Studie van de chemische samenstelling van levende cellen. Om de verdeling van stoffen en hun metabolisme in levende cellen te bestuderen, worden nucleaire magnetische resonantiemethoden en micro-elektrodetechnologie gebruikt.

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) maakt de studie mogelijk van kleine moleculen van stoffen met een laag molecuulgewicht. Een weefselmonster bevat atomen in verschillende moleculen en in verschillende omgevingen, waardoor het energie op verschillende resonantiefrequenties zal absorberen. Het absorptiediagram bij resonantiefrequenties voor een bepaald monster zal het spectrum ervan zijn NMR. In de biologie wordt het NMR-signaal van protonen (waterstofkernen) veel gebruikt om eiwitten, nucleïnezuren, enz. te bestuderen. Om macromoleculen in een levende cel te bestuderen, worden vaak isotopen 3 H, 13 C, 35 K en 31 R gebruikt om de NMR-signaal en monitor de veranderingen ervan tijdens de levensduur van de cel. Dus, 3| P wordt gebruikt om spiercontractie te bestuderen - veranderingen in het gehalte aan ATP en anorganisch fosfaat in weefsels. De 13C-isotoop maakt het mogelijk om met NMR veel processen waarbij glucose betrokken is te bestuderen. Het gebruik van NMR wordt beperkt door de lage gevoeligheid: 1 g levend weefsel moet minimaal 0,2 mm van de onderzochte stof bevatten. Het voordeel van de methode is dat deze onschadelijk is voor levende cellen.

Micro-elektrode technologie. Micro-elektroden zijn glazen buisjes gevuld met een elektrisch geleidende oplossing (meestal een oplossing van KS1 in water), waarvan de diameter aan het uiteinde wordt gemeten in fracties van een micron. De punt van zo'n buisje kan via het plasmalemma in het cytoplasma van de cel worden gebracht en de concentratie van H+, Na+, K+, C1", Ca 2+, Mg 2+ ionen bepalen, het potentiaalverschil over het plasmalemma " en injecteren ook moleculen in de cel. Om de concentratie van een specifiek ion te bepalen, worden ionselectieve elektroden gebruikt, die zijn gevuld met een ionenuitwisselingshars, die alleen doorlaatbaar is voor een bepaald ion. De laatste jaren heeft de micro-elektrodetechnologie is gebruikt om het transport van ionen door speciale ionenkanalen (gespecialiseerde eiwitkanalen) in het plasmamembraan te bestuderen. In dit geval een micro-elektrode met een dikkere punt, die stevig tegen het overeenkomstige deel van het plasmalemma wordt gedrukt. Met deze methode kunt u de functie van een enkel eiwitmolecuul bestuderen. Veranderingen in de concentratie van ionen in de cel kunnen worden bepaald met behulp van luminescerende indicatoren. Om bijvoorbeeld de intracellulaire concentratie van Ca 2+ te bestuderen, wordt het luminescerende eiwit aquarine (geïsoleerd uit kwallen) gebruikt, die licht uitzendt in de aanwezigheid van Ca2+-ionen en reageert op veranderingen in de concentratie van deze laatste binnen het bereik van 0,5-10 µM. Er zijn ook fluorescerende indicatoren gesynthetiseerd die sterk aan Ca 2+ binden. De creatie van verschillende nieuwe soorten intracellulaire indicatoren en moderne methoden voor beeldanalyse maken het mogelijk om de intracellulaire concentratie van veel laagmoleculaire stoffen nauwkeurig en snel te bepalen.

Kwantitatieve methoden

Momenteel zijn er naast kwalitatieve methoden ook kwantitatieve histochemische methoden ontwikkeld en gebruikt om het gehalte aan verschillende stoffen in cellen en weefsels te bepalen. Het bijzondere van kwantitatieve histochemische (in tegenstelling tot biochemische) onderzoeksmethoden is de mogelijkheid om de concentratie en inhoud van chemische componenten in specifieke structuren van cellen en weefsels te bestuderen.

Cytospectrofotometrie- een methode voor kwantitatief onderzoek van intracellulaire stoffen op basis van hun absorptiespectra.

Cytospectrofluorimetrie- een methode voor kwantitatief onderzoek van intracellulaire stoffen aan de hand van hun fluorescentiespectra of fluorescentie-intensiteit bij één vooraf geselecteerde golflengte (cytofluorimetrie).

Moderne microscopen - cytofluorimeters maken het mogelijk om kleine hoeveelheden van een stof in verschillende structuren (tot 10~14 -10~16 g) te detecteren en de lokalisatie van de onderzochte stoffen in microstructuren te evalueren.

Methoden voor het analyseren van afbeeldingen van cel- en weefselstructuren

De resulterende beelden van micro-objecten in een microscoop, op een televisiescherm, in elektronenmicrofoto's kunnen worden onderworpen aan speciale analyse - identificatie van morfometrische, densitometrische parameters en hun statistische verwerking.

Morfometrische methoden laat je toe om met behulp van speciale roosters (E. Weibel, A. A. Glagolev, S. B. Stefanov) het aantal structuren, hun gebieden, diameters, enz. Te bepalen. In het bijzonder kunnen in cellen de gebieden van kernen, cytoplasma, hun diameters zijn gemeten, nucleair-cytoplasmatische relaties, enz. Er zijn handmatige morfometrie en geautomatiseerde morfometrie, waarbij alle parameters automatisch worden gemeten en in het apparaat worden vastgelegd.

De laatste jaren zijn ze steeds wijdverspreider geworden automatiseringbeeldverwerkingssystemen (AIS), waardoor de meest effectieve implementatie van de bovenstaande kwantitatieve methoden voor het bestuderen van cellen en weefsels mogelijk is. Tegelijkertijd worden de analytische mogelijkheden van kwantitatieve microscopie aangevuld met methoden voor analyse en herkenning van monsters op basis van het verwerken van informatie die is geëxtraheerd uit afbeeldingen van cellen en weefsels met behulp van elektronische computers. In wezen kunnen we praten over apparaten die niet alleen de optische mogelijkheden van de menselijke visuele analysator verbeteren, maar ook de analytische mogelijkheden ervan aanzienlijk uitbreiden. Er wordt gesuggereerd dat ACOI's dezelfde revolutie in de morfologie doormaken die ongeveer 300 jaar geleden plaatsvond dankzij de uitvinding van de lichtmicroscoop, en ongeveer 50 jaar geleden - de elektronenmicroscoop, omdat ze niet alleen de productiviteit van de onderzoeker onmetelijk verhogen en niet objectiveren alleen observaties, maar maken het ook mogelijk nieuwe informatie te verkrijgen over voorheen onopgemerkte processen, en de ontwikkeling ervan in cellen en weefsels numeriek te modelleren en te voorspellen.

Tegelijkertijd vereist deelname aan een computerexperiment dat de onderzoeker een nieuwe benadering van de implementatie ervan heeft, over de vaardigheden beschikt om algoritmen voor het onderzoeksproces op te stellen, over de nauwkeurigheid van redeneren en, uiteindelijk, om het wetenschappelijke en methodologische niveau te verhogen. van het onderzoek.

Een van de methoden die het aantal morfologische problemen dat kan worden opgelost aanzienlijk heeft uitgebreid, is optisch-structurele machineanalyse (OSMA), voorgesteld in 1965 door KM Bogdanov. In 1978 ontving de auteur van de methode de USSR State Prize. Met de komst van OSMA werd een kwalitatief nieuwe stap gezet in de ontwikkeling van een uniforme methodologie voor kwantitatieve analyse van microstructuren op basis van statistische kenmerken. Onlangs heeft OSMA effectieve toepassing gevonden in de onderzoekspraktijk en de nationale economie.

In afb. Figuur 2 toont het geautomatiseerde beeldverwerkingssysteem Protva-MP dat in ons land is gemaakt door het bedrijf LOMO. Het systeem is ontworpen voor complexe onderzoeken van cellen en weefsels met behulp van absorptie-, fluorescentiemicroscopie- en autoradiografiemethoden.

Een speciale optische scan- of elektronenmicroscoop die in het systeem is opgenomen, bekijkt het beeld van het medicijn opeenvolgend in twee coördinaten, zet het om in digitale vorm en voert het in een computer in, die op zijn beurt de digitale beeldverwerking uitvoert en informatie geeft over de geometrische vorm. en andere kenmerken van het geanalyseerde object.

Met behulp van een kleurendisplay kan een onderzoeker een afbeelding ‘ontleden’, waarbij alleen de structurele componenten worden benadrukt die hem interesseren. De ruime informatieopslagapparaten op magnetische schijven of banden die in de computer zijn opgenomen, maken het mogelijk om zowel de beelden zelf als de resultaten van hun verwerking op te slaan voor latere opslag en documentatie

Laten we eens kijken naar het gebruik van methoden voor geautomatiseerde analyse van micro-objecten met behulp van het voorbeeld van beeldverwerking van een bloedleukocyt (Figuur 3). Met een scanningmicroscoop-fotometer kunt u de waarden van de optische dichtheid regel voor regel "bekijken" met een door de onderzoeker gespecificeerde stap. Als resultaat wordt het optische signaal dat overeenkomt met de optische dichtheid van het object omgezet in digitale vorm. De resulterende digitale matrix wordt voorbereid met behulp van een speciaal wiskundig apparaat

Eerst wordt de achtergrond verwijderd en wordt een “puur” object geïsoleerd - het beeld van een cel (1a), vervolgens wordt elk detail dat van belang is voor de onderzoeker geïsoleerd uit het celbeeld, bijvoorbeeld cytoplasma (16) en kern (I bestel gemiddelde en integrale waarde van optische dichtheid, dispersie, asymmetrie, kurtosis, enz. Uit het beeld van het object worden morfometrische parameters verkregen: oppervlakte, omtrek, diameter, nucleair-cytoplasmatische verhouding, vormcoëfficiënt, enz.

De volgende fase van de beeldverwerking is de constructie van tweedimensionale diagrammen van de onderlinge afhankelijkheid van de optische dichtheid voor de gehele cel (zie figuur 3), het cytoplasma (Shb) en de kern (Shv). het diagram van de hele cel (Sha) de cytoplasmatische fase kan worden onderscheiden en kernels. Met deze diagrammen kunt u histogramparameters van de tweede orde berekenen: homogeniteit, lokaal contrast, entropie, enz.

Rijst. H. Geautomatiseerde celbeeldverwerking (diagram).

Afbeelding van een leukocyt (a), zijn cytoplasma (b) en kern (c). I - digitaal beeld; II - histogrammen van optische dichtheid; III - tweedimensionale histogrammen van de afhankelijkheid van optische dichtheidswaarden.

De op deze manier verkregen parameters vertegenwoordigen een multidimensionaal “portret” van de cel en hebben een specifieke numerieke uitdrukking. Ze kunnen worden onderworpen aan verschillende methoden van statistische verwerking, waardoor een uiterst nauwkeurige classificatie van micro-objecten mogelijk is, waarbij kenmerken van hun structuur worden geïdentificeerd die visueel niet waarneembaar zijn.

Het gebruik van nieuwe onderzoeksmethoden in de histologie, cytologie en embryologie maakt het dus mogelijk om de algemene organisatiepatronen van weefsels en cellen, de structurele basis van biochemische processen die de functie van specifieke structurele componenten van de cel bepalen, te verduidelijken.

De belangrijkste onderzoeksmethode in de histologie is microscopie - de studie van histologische preparaten onder een microscoop. Onlangs is microscopie gecombineerd met andere methoden: histochemie en historadiografie. Voor microscopie worden verschillende ontwerpen van microscopen gebruikt, die het mogelijk maken om verschillende parameters van histologische preparaten te bestuderen.

De volgende soorten microscopie worden onderscheiden:

1) lichtmicroscopie (het meest voorkomende type microscopie, waarbij de resolutie van de microscoop 0,2 micron bedraagt);

2) ultraviolette microscopie (de resolutie van de microscoop is 0,1 micron);

3) luminescentiemicroscopie (gebruikt om bepaalde chemische structuren in het onderzochte histologische monster te bepalen);

4) fasecontrastmicroscopie (gebruikt om bepaalde structuren in ongekleurde histologische preparaten te detecteren en te bestuderen);

5) polarisatiemicroscopie (voornamelijk gebruikt om vezelachtige structuren te bestuderen);

6) donkerveldmicroscopie wordt gebruikt om levende objecten te bestuderen;

7) microscopie van invallend licht (bedoeld voor het bestuderen van dikke voorwerpen);

8) elektronenmicroscopie (het modernste type microscopie, met een resolutie van 0,1 - 0,7 nm). Er zijn twee soorten elektronenmicroscopie: transmissie- (transmissie) en scanning- (of oplossings-)microscopie, die afbeeldingen van oppervlakte-ultrastructuren oplevert.

Histologische en cytochemische methoden worden gebruikt om de samenstelling van chemische stoffen en hun hoeveelheden in bepaalde structuren te bepalen. Het principe van de methode is een chemische reactie tussen het reagens en het substraat in de onderzochte stof. In dit geval kunnen de resulterende bijproducten van de reactie worden gedetecteerd met behulp van licht- of fluorescentiemicroscopie.

De methode van histoautoradiografie maakt het mogelijk om de samenstelling van chemische stoffen in de onderzochte structuren en de intensiteit van de uitwisseling te identificeren op basis van de opname van radioactieve isotopen. Deze methode wordt het meest gebruikt bij dierproeven.

Met de interferonometriemethode kunt u de droge massa van een stof in levende of vaste voorwerpen bepalen.

Bij de celkweekmethode worden cellen in reageerbuizen of speciale capsules in het lichaam gekweekt en vervolgens de levende cellen onder een microscoop bestudeerd.

De essentiële kleurmethode is de introductie van een kleurstof (trefineblauw) in het bloed of de buikholte van dieren, die tijdens het leven van het dier wordt opgevangen door bepaalde cellen - macrofagen, en nadat het dier is geslacht en het preparaat is bereid, de cellen die de kleurstof bevatten worden bepaald en geteld.

Immunomorfologische methoden maken het mogelijk om, met behulp van eerder uitgevoerde immuunreacties (gebaseerd op antigeen-antilichaaminteractie), de subpopulatie van lymfocyten en de mate van vreemdheid van cellen te bepalen, histologische typering van weefsels en organen uit te voeren, d.w.z. om hun histocompatibiliteit voor verdere transplantatie.

De differentiële centrifugatiemethode is de studie van individuele organellen of zelfs hun fragmenten geïsoleerd uit een cel. Om dit te doen, wordt een deel van het onderzochte orgel gemalen, gevuld met een fysiologische oplossing en vervolgens versneld in een centrifuge met verschillende snelheden (van 2 tot 150.000 per minuut). Als resultaat van centrifugatie worden de relevante fracties verkregen, die vervolgens met verschillende methoden worden bestudeerd.

Morfometrische methoden - kwantitatieve methoden. Ze maken het mogelijk om de grootte en het volume van de kern te bepalen - karyometrie, cellen - cytometrie, organellen - elektronische morfometrie, en om het aantal cellen van verschillende populaties en subpopulaties te bepalen. Deze methoden worden veel gebruikt in wetenschappelijk onderzoek.

Verschillende experimentele methoden - voedsel- en waterbelasting, fysieke methoden (UHF, magnetron, lasers, magneten). Ze worden gebruikt om de reactie van interessante structuren op een bepaalde invloed te bestuderen en worden gecombineerd met methoden uit de morfometrie, cyto- en histochemie. Deze methoden worden ook gebruikt in wetenschappelijk onderzoek.

De belangrijkste en meest gebruikelijke onderzoeksmethode in de histologie is dus microscopie. De bereiding van een histologisch monster omvat de volgende stappen.

Materiaal meenemen

– een stukje weefsel of orgaan. Bij het verzamelen van materiaal moeten de volgende regels worden gevolgd:

1) het verzamelen van materiaal moet zo snel mogelijk na de dood of het slachten van het dier plaatsvinden, indien mogelijk van een levend voorwerp, om de structuur van de onderzochte cellen zo goed mogelijk te behouden;

2) het verzamelen van materiaal moet worden uitgevoerd met een scherp instrument om de weefsels niet te beschadigen;

3) de dikte van het stuk mag niet groter zijn dan 5 mm, zodat de fixeeroplossing de gehele diepte van het weefsel kan doordringen;

4) het is noodzakelijk om het stuk te markeren, met vermelding van de naam van het orgel, het nummer van het dier of de naam van de persoon, en de datum van verzameling.

Het materiaal bevestigen

Deze fase wordt uitgevoerd om metabolische processen in de cel te stoppen en deze tegen bederf te beschermen. Om dit te doen, wordt een stukje weefsel dat voor onderzoek is genomen, ondergedompeld in een fixeeroplossing. De oplossing kan eenvoudig zijn (alcohol of formaldehyde) of complex (de oplossing van Carnoy, het fixeermiddel van Zinker). Het fixeermiddel veroorzaakt denaturatie van eiwitten en behoudt de celstructuur in een toestand die bijna intravitaal is. Fixatie kan ook worden uitgevoerd door vriezen - koelen met vloeibare stikstof of een stroom kooldioxide.

Stukken stof in afdichtingsmedia gieten

(paraffine, harsen) – of bevriezen. Deze fase is nodig zodat er vervolgens een dunne sectie kan worden gemaakt van het te onderzoeken weefsel.

Voorbereiding van coupes op een microtoom of ultramicrotoom met behulp van speciale messen

Hierna worden secties voor lichtmicroscopie op glasplaatjes gelijmd en voor elektronische microscopie op speciale roosters gemonteerd.

Vlekkende of contrasterende delen

(voor elektronenmicroscopie). Voordat u de secties kleurt, is het noodzakelijk om het afdichtingsmedium te verwijderen: ontwas. Door middel van kleuring wordt het contrast van de bestudeerde structuren bereikt. Kleurstoffen kunnen worden onderverdeeld in basisch, zuur en neutraal. De meest gebruikte kleurstoffen zijn basisch (hematoxyline) en zuur (eosine). Ook worden vaak complexe kleurstoffen gebruikt.

Clearingsecties in xyleen en tolueen

Ze zijn ingekapseld in harsen (balsem en polystyreen) en bedekt met een dekglaasje.

Na deze procedures kan het medicijn onder een lichtmicroscoop worden onderzocht. Secties die voor een lichtmicroscoop onder glas worden geplaatst, kunnen lange tijd worden bewaard en herhaaldelijk worden gebruikt. Bij elektronenmicroscopie wordt elke sectie slechts één keer gebruikt, waarbij deze wordt gefotografeerd en de weefselstructuren worden bestudeerd met behulp van het elektronendiffractiepatroon.

Als het weefsel een vloeibare consistentie heeft (bijvoorbeeld bloed, beenmerg), wordt het preparaat gemaakt in de vorm van een uitstrijkje op een glasplaatje, dat vervolgens ook wordt gefixeerd, gekleurd en bestudeerd.

Preparaten in de vorm van een afdruk van het orgel worden gemaakt van fragiele parenchymale organen, het orgel wordt gebroken en vervolgens wordt een glasplaatje op de breukplaats aangebracht, waarop vrije cellen worden gelijmd. Hierna wordt het medicijn gefixeerd en bestudeerd.

Van sommige organen (bijvoorbeeld mesenterium, pia mater) of van los vezelig bindweefsel worden filmpreparaten gemaakt door uitrekken of pletten tussen twee glazen, gevolgd door fixatie en gieten in harsen.

Histologische onderzoeksmethoden

worden gebruikt om de structuur en functie van cellen en weefsels van mensen, dieren en plantaardige organismen te bestuderen in normale, pathologische en experimentele omstandigheden. De basis van G. m. en. is een reeks methodologische technieken die worden gebruikt bij de voorbereiding van preparaten van cellen en weefsels voor microscopisch onderzoek. Microscopisch onderzoek van cellen en weefsels kan op twee manieren worden uitgevoerd, afhankelijk van de toestand van het object dat wordt bestudeerd: het onderzoek van levende cellen en weefsels, het onderzoek van niet-levende cellen en weefsels die hun structuur behouden dankzij speciale fixatie technieken.

De studie van levende objecten - vitaal (supravitaal) - maakt het mogelijk om fysiologische processen in cellen en weefsels, hun intravitale structuur, te observeren. Het wordt uitgevoerd op cellen die vrij zijn gesuspendeerd in een vloeibaar medium (bloedcellen, epitheelcellen uit schraapsel, enz.), evenals op cel- en weefselculturen gekweekt in speciale voedingsmedia. Het object van intravitale observatie kunnen dunne, transparante weefselfilms zijn (zwemmembraan). Experimentele studies maken gebruik van de methode van biologische vensters (implantatie van transparante kamers) en de studie van weefselimplantaten in een natuurlijke transparante omgeving, bijvoorbeeld in de voorste kamer van het dierenoog. Afhankelijk van de taak die moet worden uitgevoerd, worden bij vitale onderzoeken verschillende speciale microscopiemethoden gebruikt: donkerveld, fasecontrast, fluorescentie, polarisatie, ultraviolet. Vitale histologische methoden worden vooral gebruikt voor biologisch en biomedisch onderzoek. Het wijdverbreide gebruik ervan wordt beperkt door grote technische problemen die verband houden met de eigenschappen van overlevende weefsels. Bij medisch onderzoek, vooral in de praktijk van pathologielaboratoria, worden methoden voor het bestuderen van vaste objecten gebruikt.

Het doel van fixatie is het behouden van de intravitale structuur van cellen en weefsels door ze snel bloot te stellen aan chemische middelen die de ontwikkeling van postmortale veranderingen voorkomen. De keuze van de bevestigingsmethode hangt af van de doelstellingen van het onderzoek en de kenmerken van het te bevestigen materiaal. Om fijne cellulaire structuren te identificeren, worden dus fixatieve mengsels gebruikt die zouten van zware metalen bevatten (bijvoorbeeld sublimeren).Het beste fixeermiddel voor cytologische doeleinden is osmiumtetroxide, dat vaak wordt gebruikt bij elektronenmicroscopie. Een universeel fixeermiddel is formaldehyde, gebruikt in de vorm van een 10% formaldehyde-oplossing. Om uniform en volledig te zijn, moeten de stukjes weefsel klein zijn en moet het volume van de fixeervloeistof vele malen groter zijn dan het volume van het materiaal dat wordt gefixeerd. Nadat de fixatie is voltooid, worden de stukken meestal gewassen in water of alcohol. Vaste weefselcomponenten (bijv. kalkaanslag) worden verwijderd met behulp van ontkalkingsmethoden.

De snelste en gemakkelijkste manier om een ​​weefselsectie te prepareren, meestal gebruikt voor snelle diagnostiek, is door een stuk af te snijden en weefselsecties op een invriesmicrotoom te verkrijgen. Het is echter moeilijk om voldoende dunne coupes te verkrijgen, evenals coupes van kleine voorwerpen en rottend weefsel. Daarom worden stukjes weefsel in de regel in verdichtende media - of celloïdine - gegoten. Het vaste mengsel wordt gedehydrateerd in alcoholen met toenemende sterkte, door een tussenoplosmiddel geleid (xyleen of voor paraffine, alcohol-ether voor celloïdine) en geïmpregneerd met paraffine of celloïdine. in paraffine kunt u dunnere secties verkrijgen (van 5-8 tot 1-2 µm) dan in celloïdine. Secties voor microscopisch onderzoek worden voorbereid met behulp van een slede of roterende microtoom. Ultradunne secties (dikte van 90-100 tot 5-15 nm), noodzakelijk voor elektronenmicroscopisch onderzoek, worden op een ultratoom voorbereid. Ultratoms worden ook gebruikt bij lichtmicroscopie om halfdunne secties te verkrijgen. De voorbereide secties worden gekleurd om de structuren van cellen en weefsels die kleurstoffen anders waarnemen duidelijk te benadrukken. Basiskleurstoffen - kleurende basen en hun zouten (toluidineblauw, azuurblauw, Bismarckbruin) - kleuren de zogenaamde basofiele structuren (celkernen, bindweefsel). Zure kleurstoffen - kleurzuren en hun zouten (picrinezuur, erytrosine) - kleuren acidofiele of oxyfiele structuren (cytoplasma van cellen, collageen, elastische vezels). kleuring moet worden onderscheiden door impregnatie - een speciale methode gebaseerd op bepaalde delen van cellen en weefsels om zware metalen (bijvoorbeeld zilver, goud, osmium) uit hun zouten te verwijderen en daardoor een intense kleur te verkrijgen.

De voorbereiding van een histologisch preparaat wordt voltooid door het in media te plaatsen die het behoud van de structuur van het object, de kleur en transparantie ervan garanderen. Voor deze doeleinden worden bijvoorbeeld meestal organische harsen gebruikt.

1. Kleine medische encyclopedie. - M.: Medische encyclopedie. 1991-96 2. Eerste hulp. - M.: Grote Russische encyclopedie. 1994 3. Encyclopedisch woordenboek met medische termen. - M.: Sovjet-encyclopedie. - 1982-1984.

Zie wat “Histologische onderzoeksmethoden” zijn in andere woordenboeken:

Methodologische benaderingen en onderzoeksmethoden in de menselijke anatomie- Soms hoor je dat er in de anatomie niets meer over is om te studeren, te onderzoeken, zogenaamd zijn alle onderwerpen uitgeput, alles wat bestudeerd kon worden is al bestudeerd, alle vragen zijn opgelost. Alsof alles wat te maken heeft met de structuur van het menselijk lichaam... ... Verklarende woordenlijst met termen en concepten over de menselijke anatomie

LABORATORIUMONDERZOEK- LABORATORIUMONDERZOEK. zie LABORATORIUMONDERZOEKEN. De belangrijkste voorwaarde voor het verkrijgen van betrouwbare onderzoeksresultaten is de juiste keuze van analyseobjecten, hun tijdige selectie en formulering van het onderzoeksprobleem. Bemonsteringsregels... Visziekten: een gids

I Geneeskunde Geneeskunde is een systeem van wetenschappelijke kennis en praktische activiteiten, met als doel het versterken en behouden van de gezondheid, het verlengen van het leven van mensen, het voorkomen en behandelen van ziekten bij de mens. Om deze taken te volbrengen, bestudeert M. de structuur en... ... Medische encyclopedie

Methoden voor het bestuderen van verschillende objecten met behulp van een microscoop. In de biologie en de geneeskunde maken deze methoden het mogelijk om de structuur van microscopische objecten te bestuderen waarvan de afmetingen de resolutie van het menselijk oog te boven gaan. De basis van M.m.i. bedraagt... ... Medische encyclopedie

- (histologische cytuscel + Griekse logos-doctrine) is gebaseerd op het met behulp van een microscoop bestuderen van de structurele kenmerken van cellen, de cellulaire samenstelling van weefselorganen, lichaamsvloeistoffen van mensen en dieren onder normale omstandigheden en bij pathologische processen. TS en.... ... Medische encyclopedie

I Histologie (Griekse histos tissue + logos doctrine) is een medisch-biologische wetenschap die de evolutie van weefsels, hun ontwikkeling in het lichaam (histogenese), structuur, functies en interacties bij meercellige dieren en mensen bestudeert. Het hoofdonderwerp van G.... ... Medische encyclopedie

I Vulva (vulva; pudendum femininum) uitwendige vrouwelijke genitaliën (volgens de Internationale Anatomische Nomenclatuur, vrouwelijk geslachtsdeel). Anatomie en fysiologie. De vulva (Fig. 1) bevindt zich buiten de schaambeenderen van het bekken en is daaraan vastgemaakt... ... Medische encyclopedie

Door de veranderingen te bestuderen die in het lichaam worden veroorzaakt door verschillende ziekteprocessen, is het doel van de inherente onderzoeksmethoden om zowel deze ziekteprocessen als hun betekenis in relatie tot het klinische beeld van de ziekte en de dood te bepalen... ... Encyclopedisch woordenboek F.A. Brockhaus en I.A. Efron

I Biopsie (Grieks bios leven + opsis visie, visuele perceptie) intravitale afname van weefsels, organen of een suspensie van cellen voor microscopisch onderzoek voor diagnostische doeleinden, evenals om de dynamiek van het pathologische proces en de invloed ervan te bestuderen... .. . Medische encyclopedie

De wetenschap die zich bezighoudt met de studie van dierlijk weefsel. Weefsel is een groep cellen die qua vorm, grootte, functie en hun metabolische producten vergelijkbaar zijn. Bij alle planten en dieren, met uitzondering van de meest primitieve, bestaat het lichaam uit weefsels... ... Collier's Encyclopedie

- (van het Griekse ἱστός weefsel en het Griekse λόγος kennis, woord, wetenschap) een onderdeel van de biologie dat de structuur van weefsels van levende organismen bestudeert. Meestal gebeurt dit door het weefsel met behulp van een microtoom in dunne lagen te snijden. In tegenstelling tot anatomie, ... ... Wikipedia

Boeken

• Multipel myeloom en plasmacelziekten, Ramasamy Karthik, Loniale Sagar. Het boek presenteert de belangrijkste klinische aspecten van multipel myeloom en andere plasmacelziekten. Laboratoriumonderzoek, pathogenese, diagnose en behandeling worden beschreven. In de seconde...