МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Хроматография ОФС.1.2.1.2.0002.15
на бумаге Взамен ст. ГФ XI , вып.1
Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы, называется хроматографией на бумаге.
Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, предварительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным или адсорбционным. Перемещение подвижной фазы происходит либо только под действием капиллярных сил (восходящая хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).
При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бумаге зоны адсорбции в виде круглых или овальных пятен или полос в зависимости от способа нанесения (в точку или полосой). Совокупность зон адсорбции, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хроматограммой.
Подвижность вещества при хроматографировании характеризуется фактором удерживания R f , (см. ).
Область применения
Бумажная хроматография может использоваться для установления подлинности, чистоты и количественного определения анализируемого вещества.
Подлинность подтверждается при одновременном хроматографировании на одном листе бумаги анализируемого и стандартного вещества. Если образцы идентичны, то соответствующие им зоны адсорбции на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения R f . Для идентификации иногда целесообразно хроматографировать смесь равных количеств анализируемого и стандартного вещества. На хроматограмме должно наблюдаться одно пятно, характеризующее зону адсорбции. Условия хроматографирования следует подбирать так, чтобы значения R f были отличны от 0 и не превышали 1. Кроме того, для подтверждения подлинности анализируемого вещества могут быть использованы конкретные условия его детекции, указанные в фармакопейной статье.
При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество должны иметь разные значения R f . О степени чистоты анализируемого вещества можно судить по величине и интенсивности окраски (или поглощения) обнаруживаемых на хроматограмме зон адсорбции примесей. Содержание примесей может быть определено полуколичественно. Для этого на одном листе бумаги одновременно хроматографируют определенное количество анализируемого вещества и несколько образцов определяемой примеси (свидетеля) c различными, точно известными концентрациями. Содержание примеси в анализируемом образце оценивают, сравнивая ее зону адсорбции на хроматограмме по совокупности площади зоны адсорбции и интенсивности окраски (или поглощения) с зонами адсорбции свидетеля.
Для количественного анализа применяют специальные приборы, позволяющие проводить измерения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Для обработки хроматограмм в видимой области спектра целесообразно использовать планшетные сканеры и соответствующее программное обеспечение.
можно также проводить количественное определение веществ после их экстракции с хроматограммы. Для этого зоны адсорбции вырезают и экстрагируют определяемое вещество подходящим растворителем. Содержание анализируемого вещества в извлечении или сухом остатке после отгонки растворителя находят любым методом, пригодным для определения малых концентраций и учитывающим строение анализируемого вещества.
Проба испытуемой смеси может наноситься либо точечно на линию старта, либо в виде равномерной полосы вдоль всей линии старта, при этом первичная зона адсорбции будет иметь вид пятна, а во втором случае – полосы, параллельной линии старта.
Оборудование
Для проведения хроматографии на бумаге используют герметизированные камеры, изготовленные из инертного материала и позволяющие наблюдать за ходом процесса разделения при закрытой крышке камеры. Часто в качестве камер используют стеклянные стаканы или цилиндры с пришлифованной крышкой и дополнительно герметизированные. На крышке могут быть входные отверстия (шлюзы) для добавления растворителя или снятия избыточного давления в камере.
При проведении нисходящей хроматографии в верхней части камеры помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Лодочка должна вмещать объем подвижной фазы, достаточный для проведения, по крайней мере, однократного хроматографирования. Длина лодочки должна превышать ширину листа хроматографической бумаги. Камера должна быть снабжена устройствами для закрепления листа хроматографической бумаги в рабочем положении и для ввода в лодочку подвижной фазы.
При проведении восходящей хроматографии подвижную фазу помещают либо в лодочку, установленную в нижней части камеры, либо наливают на дно камеры.
Внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, что способствует более быстрому и полному ее насыщению парами растворителей, входящих в состав подвижной фазы.
Подготовку оборудования, хроматографической бумаги и подвижной фазы приводят в фармакопейных статьях.
Методики хроматографического разделения
Бумажная хроматография может быть одномерной и двумерной.
Одномерная бумажная хроматография предполагает точечное нанесение или нанесение в виде полосы пробы исследуемой смеси на линию старта и последующее хроматографирование в одном направлении (рис. 1).
Рисунок 1 – Примерная схема одномерной бумажной хроматографии
Двумерная хроматография предполагает последовательное прохождение подвижной фазы в двух перпендикулярных направлениях, что позволяет обеспечить более четкое разделение смеси анализируемых веществ (рис. 2).
Рисунок 2 – Примерная схема двумерной бумажной хроматографии
Нисходящая хроматография
На дно хроматографической камеры помещают неподвижную или подвижную фазу в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 2,5 см. Камеру закрывают и оставляют для насыщения на 24 ч при постоянной температуре. В отдельных случаях, при использовании достаточно летучих растворителей, это время может быть сокращено.
Растворы веществ наносят на линию старта микропипеткой или микрошприцем так, чтобы расстояние между точками нанесения отдельных проб было не менее 3 см. Если минимальное, необходимое для проведения хроматографирования количество анализируемого раствора может образовывать на бумаге первичную зону адсорбции в виде пятна, превышающего в диаметре 10 мм, нанесение проводят в несколько приемов, предотвращая путем подсушивания чрезмерную диффузию на линии старта. После нанесения растворов анализируемых веществ и высыхания образовавшейся при этом первичной хроматограммы полосу бумаги закрепляют в рабочем положении в камере и оставляют на 1,5 ч. В рабочем положении полоса хроматографической бумаги должна висеть вертикально так, чтобы между ее верхним концом, погруженным в лодочку, и линией старта был лишь один, по возможности плавный, перегиб. По окончании выдержки начинают хроматографирование, для чего в лодочку вливают подвижную фазу. Хроматографирование обычно заканчивают при приближении фронта подвижной фазы к нижнему концу полосы бумаги. Если в фармакопейной статье нет специальных указаний, полосу вынимают из камеры и сушат на воздухе, отметив графитовым карандашом конечное положение фронта подвижной фазы. Детекцию зон адсорбции осуществляют согласно указаниям фармакопейной статьи.
Восходящая хроматография
Для проведения восходящей хроматографии на бумаге используют камеры, в которых сосуд (лодочка) с подвижной фазой располагается в нижней части или на дне. Полоса хроматографической бумаги закрепляется в верхней части камеры так, чтобы обеспечить возможность погружения нижнего конца полосы в лодочку с подвижной фазой. В рабочем положении полосы линия старта должна отстоять от поверхности подвижной фазы на 2 – 3 см. В остальном приемы работы при проведении восходящей хроматографии на бумаге не отличаются от описанных выше.
Подготовка фаз и бумаги
При приготовлении несмешивающихся систем растворителей, совместно используемых при хроматографии в качестве подвижной и неподвижной фазы, необходимо обеспечить их взаимное насыщение, например, путем встряхивания в делительной воронке. При этом в фармакопейной статье должно быть указано, какую из фаз используют для хроматографирования.
Фильтровальную бумагу нужной плотности квалификации «для хроматографии» разрезают в направлении, перпендикулярном или параллельном волокнам, на листы (полосы), длина которых приблизительно равна высоте камеры. Ширина этих полос может быть приблизительно определена по формуле: А = 3(К + 1), где А – ширина полосы (см), К – количество хроматограмм на полосе.
На каждой полосе бумаги для обозначения мест нанесения хроматографируемых веществ графитовым карандашом проводят прямую линию, называемую линией старта. Расстояние от конца полосы бумаги до линии старта выбирается так, чтобы при погружении бумаги в лодочку исключалось непосредственное соприкосновение нанесенных на линию старта веществ с жидкостью, находящейся в лодочке.
На приготовленные таким образом листы фильтровальной бумаги, если указано в фармакопейной статье, наносят неподвижную фазу. Для этого соответствующие труднолетучие растворители (формамид, пропиленгликоль и т.п.) смешивают с легколетучими растворителями и в полученную смесь на 1 – 2 с погружают подлежащие обработке листы бумаги. Избыток смеси с поверхности листов снимают, обжимая их между двумя слоями фильтровальной бумаги, после чего летучий компонент смеси удаляют высушиванием на воздухе в течение 15 – 20 мин.
Если в качестве неподвижной фазы рекомендован водный раствор нелетучих веществ, то бумагу обрабатывают этим раствором, сушат, как указано выше, а перед хроматографированием выдерживают в камере, содержащей пары воды. Нанесение на бумагу легколетучих компонентов неподвижных фаз осуществляется путем выдерживания ее в парах фазы в камере непосредственно перед хроматографированием.
Детекция зон адсорбции
По окончании хроматографирования хроматограммы подсушивают до удаления следов растворителей и просматривают в видимом или ультрафиолетовом свете (при определенной длине волны детектора, указанной в фармакопейной статье), отмечая при этом зоны адсорбции. В ряде случаев для обнаружения зон адсорбции хроматограмму подвергают обработке специальными реагентами, образующими с анализируемыми веществами окрашенные продукты реакции, путем опрыскивания или погружения в раствор реагента.
Способ детекции зон адсорбции должен быть обязательно указан в соответствующей фармакопейной статье на лекарственное средство.
При бумажной хроматографии неподвижной жидкой фазой служит вода, адсорбируемая волокнами бумаги в количестве до 20%, ил другой полярный растворитель; в качестве подвижной фазы чаще всего применяют бутиловый спирт, коллидин, фенол, крезолы. Носителем служит хорошая фильтрованная бумага, достаточно однородная по толщине и плотности.
Для разделения смеси способом бумажной хроматографии каплю исследуемого раствора наносят на полоску фильтрованной бумаги шириной 15-20 мм и длиной 300-500 мм на расстоянии 20-30 мм от конца. Конец полоски погружают в соответствующий органический растворитель, предварительно насыщенной водой, а весь прибор помещают в герметическую камеру, атмосфера в которой насыщена парами органического растворителя и воды. Движение растворителя вдоль полоски бумаги, происходящее вследствие капиллярных сил, обеспечивает проявление хроматограммы, причем отдельные зоны перемещаются с различной скоростью.
Двумерная хроматография на бумаге
Еще более точные результаты получаются при помощи так называемой двухмерной хроматографии на бумаге. Для этого варианта применяют не полоски фильтрованной бумаги, а прямоугольники размером примерно 400Х500 мм. Каплю исследуемого раствора наносят вблизи одной из вершин прямоугольника, а Хроматограмму проявляют дважды различными растворителями, например фенолом и коллидином, сперва одним растворителем, а затем, после поворота на 90?, -другим.
Методы проявления хроматограмм
Восходящая хроматография. Бумага погружается нижним концом в подвижную фазу. Подъём жидкости происходит под действием капиллярных сил.
«+» Прибор прост, возможна количественная оценка результатов;
«-» Сила тяжести и капиллярные силы действуют в противоположных направлениях; скорость всасывания после подъема до 20 см сильно падает. Применима для веществ, имеющих достаточно большие различия в значениях Rf
Нисходящая хроматография. Бумага погружается в подвижную фазу верхним концом. Стекание жидкости происходит под действием силы тяжести.
«+» - быстрое прохождение подвижной фазы; отсутствие ограничения длины пробега пятен (проточная хроматограмма); возможно разделение веществ с незначительно отличающимися значениями Rf и количественная оценка результатов.
«-» - Прибор сложнее, чем для восходящей хроматографии.
Рис. 5.
Радиально-горизонтальная хроматография. Подвижная фаза непрерывно наносится в центр круглого листа бумаги.
«+» - Быстрое выполнение, зоны узки и резко очерчены; большая полнота разделения, чем для первых методов.
«-» - Возможна только качественная оценка результатов; применение «свидетелей» возможно только лишь при так называемом «секретном методе» (т.е. при делении бумаги на секторы).
Приготовление подвижной фазы
Ниже описан простейший случай хроматографии на бумаге - восходящая хроматография с водой в качестве восходящей фазы.
Компоненты выбранной системы растворителей смешивают в указанном соотношении в делительной воронке. Две несмешивающиеся фазы доводят при помощи встряхивания до взаимного насыщения; в качестве подвижной фазы выступает органическая.
Нанесение вещества
Из бумаги определенного сорта вырезают полоску, размер которой соответствует размерам применяемого для хроматографии цилиндра. На расстоянии 3 см от нижнего края карандашом наносят маркировочную линию. На этой линии через 2 - 2,5 см друг от друга и от краев полоски помечают точки старта. Специальной пипеткой наносят каждую точку старта; при этом образуются пятна около 1 см в диаметре. Затем растворителю дают испариться.
тонкослойный хроматография растворитель бумага
Проявление
На дно цилиндра наливают подвижную фазу и подвешивают полоску бумаги. Оставляют ее так висеть в течение ночи, а затем нижний край полоски погружают на 0,5 см в подвижную фазу. После того как растворитель поднимется на 20 - 25 см, полоску вынимают, отмечают карандашом положение фронта растворителя и Хроматограмму высушивают.
БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ, метод разделения, идентификации и количественного определения веществ; один из плоскостных вариантов жидкостной хроматографии, в котором в качестве неподвижной фазы или инертного носителя неподвижной фазы используют специальную бумагу. Метод бумажной хроматографии предложен А. Мартином и Р. Сингом в 1944 году для анализа смесей аминокислот.
Разделение компонентов смеси происходит вследствие распределения веществ между неподвижной фазой и подвижной (элюентом); равномерное продвижение элюента вдоль слоя неподвижной фазы обеспечивается капиллярной структурой бумаги. Перенос компонентов элюентом происходит с различными скоростями в соответствии с их коэффициентом распределения. В результате на хроматограмме вещества образуют отдельные зоны (пятна), положение которых характеризуется величинами R f - относительной скоростью перемещения. Экспериментально величину R f определяют как отношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному за это же время элюентом; R f ≤1; величина R f зависит от природы вещества, состава подвижной фазы, типа бумаги, техники эксперимента и не должна зависеть от концентрации определяемого вещества и присутствия других веществ. Окрашенные зоны на хроматограмме наблюдают визуально, неокрашенные проявляют реагентами, образующими с компонентами разделяемой смеси окрашенные или флуоресцирующие соединения. Идентификация веществ может быть основана на сопоставлении величин R f исследуемого и стандартного растворов. Количественный анализ осуществляют непосредственно на хроматограмме (по размеру пятна, спектрам поглощения или отражения, с помощью денситометрии, радиометрии и пр.) или после отделения (например, экстрагированием) вещества хроматографической зоны от целлюлозной основы (для определения используют спектрофотометрические, флуориметрические, атомно-абсорбционные и другие методы).
Бумажные хроматограммы можно получать путём восходящего, нисходящего или горизонтального (радиального) движения элюента; используя повторное разделение, получают двухмерные хроматограммы. Разделение проводят в закрытых камерах (стаканах, цилиндрах и др.), насыщенных парами подвижной фазы. Для разделения гидрофильных соединений используют специальную хроматографическую бумагу (из целлюлозных волокон), содержащую в качестве неподвижной фазы воду или иониты. Для разделения нерастворимых в воде соединений бумагу гидрофобизируют ацетилированием или пропиткой гидрофобными веществами (парафин, каучук, органические реагенты и др.). В качестве элюентов используют различные растворители или их смеси, водные растворы органических и неорганических кислот, спиртов, электролитов и пр.
Методом бумажной хроматографии можно анализировать малые количества (10 -9 -10 -6 г) химических соединений практически всех классов. Благодаря технической простоте и доступности бумажную хроматографию используют при обнаружении легко разделяемых веществ, при проверке индивидуальности органических соединений, определении следов элементов в геохимическом анализе и пр.
Лит.: Хроматография на бумаге. М., 1962; Хроматография. Практическое приложение метода. М., 1986. Т. 1-2; Основы аналитической химии / Под редакцией Ю. А. Золотова. 2-е изд. М., 1999. Кн. 1.
Распределительная хроматография. Бумажная хроматография. Осадочная хроматография. Понятие оситовой (эксклюзионной) хроматографии. Гель-хроматография.
Распределительная хромотография.
хроматографический метод, при котором неподвижная (стационарная) фаза химически связана с поверхностью неподвижного носителя. Подвижной фазой является жидкость, которая служит растворителем, или газ (газовая хроматография). Разделение происходит за счёт различия полярности разделяемых веществ. При распределительной хроматографии носитель пропитывается одним из растворителей (“неподвижный растворитель”), а другой растворитель (“подвижный ”) пропускают через колонку носителя. В качестве неподвижного растворителя чаще всего берут воду или другие полярные жидкости (серную кислоту, метиловый спирт и т.д.); в качестве подвижного растворителя - менее полярные жидкости, не смешивающиеся с первыми во всех соотношениях. Порцию исследуемой смеси веществ, растворенную в подвижном растворителе, вводят в колонку и после того, как раствор впитается верхней частью колонки, начинают промывание колонки чистым подвижным растворителем. В процессе промывания происходит непрерывное перераспределение веществ смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Так как разные компоненты смеси имеют различные коэффициенты распределения, скорость передвижения отдельных компонентов различная. Наибольшей скоростью движения будет обладать тот компонент смеси, который имеет наибольший коэффициент распределения: C
C = неподв.
т.е. отношение концентраций растворенного вещества в подвижной фазе к его концентрации в неподвижной фазе.
Одним из основных условий получения четкого разделения смеси методом распределительной хроматографии является практическое отсутствие какого-либо взаимодействия компонентов смеси с носителем. Если это условие соблюдается, то при промывании колонки происходит полное разделение смеси. Число носителей, пригодных для распределительной хроматографии, крайне ограничено. Более или менее удовлетворительными качествами обладают такие носители, как особым образом, приготовленный силикагель, очищенный крахмал, целлюлоза.
Бумажная хромотография.
берется полоса фильтровальной бумаги длиной 30-50 см и шириной 1,5 см. На один из концов этой полосы на некотором расстоянии от края наносится капля смеси анализируемых веществ. Затем этот конец бумаги опускается в ванночку, содержащую органический растворитель, насыщенный водой. При медленном продвижении растворителя через поры бумаги происходит непрерывное перераспределение веществ смеси между двумя жидкими фазами. Если разные компоненты смеси имеют различные коэффициенты распределения, то скорость продвижения отдельных компонентов смеси будет различной. Движение подвижного растворителя по бумаге может быть как нисходящим, так и восходящим. После того, как хроматографирование заканчивается, полосу бумаги высушивают и затем проявляют реактивом, дающим цветную реакцию с анализируемыми соединениями. Полученная хроматограмма представляет собой совокупность цветных пятен, расположенных в определенном порядке вдоль полосы бумаги.
Рис. 22. А - восходящая хроматограмма; Б - нисходящая хроматограмма; 1 - сосуд для хроматографирования; 2 - резервуар с растворителем; 3 - хроматографическая бумага; 4 - стартовые точки; 5 - разделенные компоненты; 6 - фронт растворителя.
При нисходящей хроматографии растворитель движется вниз по бумаге из расположенного в верхней части сосуда резервуара с растворителем. Таким способом можно элюировать отдельные компоненты. Наиболее распространенные системы растворителей: СН3СООН-Н2O (15:85 объем), 1-бутанол - СН3СООН-Н20 (4:1:5), 2-пропанол - NH3 (конц.) - Н2O (9:1:2), 1-бутанол - 1,5 н. NH3 (1:1), фенол - вода и др. Состав подвижной фазы обычно подбирают экспериментально или ориентируясь на данные, приведенные в справочниках или монографиях по бумажной хроматографии.
Осадочная хроматография - метод хроматографии, основанный на способности разделяемых веществ образовывать малорастворимые соединения с различными произведениями растворимости. В качестве неподвижной фазы выступает инертный носитель, покрытый слоем осадителя; разделяемые вещества, находящиеся в подвижной фазе, вступают во взаимодействие с осадителем и образуют малорастворимые вещества - осадки. При дальнейшем пропускании растворителя происходят поочерёдно: растворение этих осадков, перенос вещества по слою неподвижной фазы, снова осаждение и т. д. При этом скорость перемещения осадка по неподвижной фазе пропорциональна его произведению растворимости (ПР). Хроматограммой в данном случае будет являться распределение осадков по слою носителя. В качестве примера можно привести разделение галогенид-ионов на носителе (силикагель, целлюлоза и т. д.), пропитанном солью серебра. Можно использовать для разделения осадков их неодинаковую растворимость в различных растворителях или в растворах с различной ионной силой. Реализуется как в колоночном, так и в плоскостном варианте.
Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография (ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационная хроматография) - разновидность хроматографии, в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии, при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует. В колонку вносят раствор образца, объём которого является лимитирующим для качества хроматографии. Для аналитических разделений он не должен превышать 0,1 % от CV (общего объёма колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10 % от CV. Колонка упакована порошком, частицы или гранулы которого имеют поры определенного диаметра. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры, проходят между гранулами, поэтому их объём удержания равен объёму колонки за вычетом объёма стационарной фазы (так называемый, свободный объем). Они элюируются первыми. Молекулы средних размеров помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объём удержания несколько выше свободного объёма. Они элюируется вторыми. Самые мелкие молекулы свободно входят в поры вместе с молекулами растворителя. Поэтому их объём удержания в колонке намного выше свободного и приближается к общему объёму колонки (то есть 100 % CV). Они элюируются последними.
Качественный химический анализ. Классификация методов качественного анализа (дробный и систематический, макро-, полумикро-, микро-, ультрамикроанализ). Аналитические реакции и реагенты, используемые в качественном анализе (специфические, селективные, групповые). Использование качественного анализа в фармации.
Качественный анализ - идентификация (обнаружение) компонентов анализируемых веществ и приблизительная оценка количества их содержания в веществах и материалах. В качестве компонентов могут быть атомы и ионы, изотопы элементов и отдельные нуклииды, молекулы, функциональные группы и радикалы, фазы и т.д.
Классификация методов Метод анализа выбирают в зависимости от предполагаемого содержания вещества и от предела обнаружения применяемой реакции. В настоящее время при изучении качественного химического анализа в учебных лабораториях применяется полумикроанализ.